PCR-RFLP 法鉴别罗布麻与混淆品白麻及其psbA-trnH 序列分析

刘 流，邰顺章，支荣荣

盐城市食品药品监督检验中心，盐城 224055

中药罗布麻叶为《中国药典》[1]一部收录，为夹竹桃科植物罗布麻Apocynum venetum L.的干燥叶，具有平肝安神、清热利水的功效，用于肝阳眩晕、心悸失眠、浮肿尿少等症。近年来，发现市售样品由白麻（A.pictum）叶混充罗布麻叶的情况较为普遍，两者成分和功效均有差异[2，3]。《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》[4]中收录的大花罗布麻Poacynum hendersonii（Hook.f.）Woodson.的干燥叶即白麻（A.pictum）；但是原则上地方药材不适用于无此标准的其他省区。因此罗布麻叶和白麻叶应严格区分。

在《中国药典》[1]中，对罗布麻叶的性状鉴别描述与《新疆维吾尔自治区维吾尔药材标准》[4]对白麻叶的性状鉴别描述基本一致，且罗布麻叶多皱缩卷曲、有的破碎，给外观鉴别带来困难[5]；同时，两文献的显微鉴别描述也缺少显著特征差异；两种药材主要成分的种类是类似的，仅含量差异，且因为生长环境与采收季节的关系，含量会发生变化，采用薄层色谱和高效液相色谱检测主要化学成分的含量不能有效区分罗布麻与白麻[2，6]。故按现行质量标准用性状、显微、理化鉴定等传统方法难以区分罗布麻和白麻，因此有必要开发新的方法用于区分两种药材。

《中国药典》一部应用分子生物学方法鉴定川贝母、霍山石斛、蕲蛇、乌梢蛇、金钱白花蛇，其中川贝母和霍山石斛鉴定方法为PCR-RFLP，即聚合酶链式反应－限制性内切酶长度多态性方法。

多个研究表明，ITS2 和psbA-trnH 序列可以作为植物通用DNA 条形码，可有效鉴别植物中药材[7]。本实验扩增并测序了罗布麻和白麻的ITS2 和psbA-trnH 序列，去除测序引物端不可靠序列，序列分析结果显示，两者ITS2 序列仅2 bp 碱基差异，而psbA-trnH 序列有一段22 bp 的差异。psbA-trnH 位于植物叶绿体基因组的psbA 基因和trnH 基因的间隔区，起着重要的调控作用，有一定的变异率和相对的保守性，在多个物种的进化研究中扮演重要角色。

本实验选择在psbA-trnH 序列的基础上，利用22 bp 的差异序列，建立一个可行的分子生物学方法，鉴别罗布麻和白麻；并对亲缘关系相近物种的psbA-trnH 序列进行分析，确认此方法具有特异性。

1 材 料

1.1 仪器

SimpliAmp PCR 测序仪（Thermo Scientific 公司）；超微量分光光度计One Drop OD1000+（南京五义科技有限公司）；电泳仪Tanon EPS 300（上海天能科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

植物基因组DNA 小量纯化试剂盒（批号AJG2100A）、Ssp Ⅰ（批号AK11181A）TaKaRa 公司；2XTaq PCR MasterMix Ⅱ（批号S7812）、Gene Green核酸染料（批号S8121）、DNA MarkerⅠ（批号R7109）天根生化科技北京有限公司；TAE Buffer Premixed Powder（1X，批号F701KA2248）、琼脂糖B 低电渗（批号F520BA0015）生工生物工程上海股份有限公司。

1.3 药材

抽检标示罗布麻样品21 批，经本文通讯作者鉴定，其中7 批为罗布麻，14 批为白麻。样本信息见表1。

表1 罗布麻和白麻样本信息

2 方 法

2.1 总DNA 提取

取样品叶片约0.1 g 于陶瓷研钵（洗净经165 ℃，4 h 高温烘烤），加液氮快速研磨至极细粉末，取20～50 mg 粉末，按照MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit 试剂盒说明（Protocol Ⅱ）提取总DNA，其中56 ℃水浴时间延长至20 min，提取产物用TE 缓冲液溶解之前放置室温15 min，使乙醇挥发完全，TE 缓冲液加热至65 ℃以提高洗脱效率。以微量分光光度计检测浓度和纯度，21 批样本的总DNA 浓度为2～10 ng·μL-1，A260/A280为1.6～1.8。

2.2 psbA-trnH 扩增

引物序列来源于《中国药典》四部[8]。正向引物psbAF（5ˊ-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3ˊ），反向引物trnHR（5ˊ-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3ˊ）。引物短暂离心，按照管壁上的说明加适量TE 缓冲液溶解成100 μmol·L-1的贮备液，并取部分稀释成2.5 μmol·L-1的工作溶液。

25 μL 扩增体系包含：2X Taq PCR Master MixⅡ12.5 μL（说明：此Mix 中的DNA 聚合酶为高保真酶，以确保测序结果的准确性），上游引物psbAF（2.5 μM）1 μL，下游引物trnHR（2.5 μM）1 μL，灭菌ddH2O 8.5 μL，DNA 模板2 μL。psbA-trnH 扩增程序参考《岭南中草药DNA 条形码序列》[9]并作适当调整：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35 个循环；72 ℃充分延伸5 min。PCR扩增产物于GeneGreen 染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳、成像，观察条带是否明亮清晰、无杂带且空白对照无条带。一共21 个样本的PCR 产物电泳确认合格，送生工双向测序，测序引物为扩增引物psbAF和trnHR。

2.3 酶切位点分析

测序结果用软件Chromas2.6.6（Technelysium Pty Ltd）和软件CodonCode Aligner 9.0.1（Codon-Code Corporation）得到可信序列，然后进行Nucleotide BLAST 比对，确认测序结果可靠后进行酶切位点分析，查找特异性酶切位点。

2.4 psbA-trnH 扩增并酶切

21 批样本进行psbA-trnH 扩增，扩增过程同“2.2”。扩增后电泳检测，确定条带明亮清晰无杂带，大小为300～400 bp。PCR 产物直接酶切，20 μL 酶切体系：Ssp Ⅰ内切酶1 μL，10X buffer 2 μL，ddH2O 12 μL，PCR 产物5 μL。37 ℃水浴进行酶切反应，1.5 h 后每个体系加10X loading buffer 2 μL 终止酶切反应。电泳观察结果。

2.5 psbA-trnH 序列分析

2.5.1 酶切位点种间特异性分析 获取NCBI 核酸数据库中罗布麻近缘物种psbA-trnH 序列，分析本方法采用的酶切位点是否具有特异性，即在其他物种中没有此酶切位点。如果在其他物种中有此酶切位点，观察酶切后的条带大小是否与罗布麻有区别。

2.5.2 酶切位点种内保守性分析 考察本实验测序的7 条罗布麻psbA-trnH 序列以及NCBI 中的所有罗布麻psbA-trnH 序列，分析本方法采用的酶切位点是否保守，即是否都在相同位置有相同酶切位点。

2.5.3 分子进化分析 基于NCBI 核酸数据库psbA-trnH 序列，构建夹竹桃族各种属的进化树，考察与罗布麻亲缘关系近的种属。

2.5.4 其它实验条件考察 对DNA 提取量、试剂盒、退火温度等实验条件进行考察。

3 结果与分析

3.1 酶切位点分析

用软件Chromas 2.6.6（Technelysium Pty Ltd）查看测序得到的.ab1 文件，确认峰形正常；对42 条序列Trim Low Quality，显示除两端引物区外的其余部分结果可信。软件CodonCode Aligner 9.0.1（Codon-Code Corporation）将同一个样本的两条序列的峰图拼接起来，去除两端不可信区域，得到21 条psbAtrnH 序列。将这21 条psbA-trnH 序列在NCBI 进行Nucleotide BLAST：AV1～AV7 最高分结果为A.venetum chloroplast，complete genome（GenBank：MT313688.1），为罗布麻的序列；AP1～AP14 最高分结果为A.pictum voucher 65230438 PsbA（psbA）gene，partial cds（GenBank：KP152531.1），为白麻的序列；psbA-trnH 序列Nucleotide BLAST 结果与表1 鉴定的结果相符。

用软件MEGA X[10]进行多序列比对（MUSCL法），结果显示（表2，“.”表示碱基与首行一致，“-”表示碱基缺失），与罗布麻组相比，白麻组有一段22bp 的序列缺失（gap），序列为5’-AGAATAGTAAATATTCTAAATA-3’。

表2 psbA-trnH 序列比对结果

用软件DNAMAN 进行酶切位点分析，此段gap序列包含一个特异性的Ssp Ⅰ酶切位点AAT/ATT，psbA-trnH 其他部分不含此酶切位点。即罗布麻psbA-trnH 含有特异性酶切位点Ssp Ⅰ，白麻psbAtrnH 不含此酶切位点。

3.2 PCR-RFLP 结果

21 个样本进行psbA-trnH 扩增，Ssp Ⅰ酶切，以电泳观察结果。琼脂糖凝胶浓度为1.5%且用GeneGreen 染色，每个样本先点一个扩增产物，再点一个酶切产物，进行对比，如孔1 为AV1 扩增产物，孔2 为AV1 酶切产物。Marker 上样量为3 μL，扩增产物上样量为3 μL，酶切产物上样量为8 μL。电泳条件为105 V，45 min。结果显示，罗布麻均可以酶切为228 bp 和108 bp 两个片段，白麻均不能酶切，见图1。本实验建立的扩增psbA-trnH 片段并用SspⅠ酶切的方法可以有效鉴别罗布麻和白麻。

图1 罗布麻和白麻Ssp I 酶切验证

4 psbA-trnH 序列分析

4.1 酶切位点种间特异性分析

在NCBI 分类学数据库Taxonomy 中，夹竹桃族（Apocyneae）收录了7 个亚族、35 个属，其中12 个属有psbA-trnH 序列信息。罗布麻属有6 个种，包括罗布麻和白麻，其中有5 个种有psbA-trnH 序列，金平藤缺少psbA-trnH 序列信息。下载夹竹桃族的所有相关序列，有的为叶绿体基因组序列，有的为包含psbA-trnH 的短序列，分别与引物psbAF/trnHR 进行序列比对，得到各个物种的psbA-trnH序列，并进行Ssp Ⅰ酶切位点分析，包含Ssp Ⅰ酶切位点的序列一共5 条。信息见表3。

表3 夹竹桃族psbA-trnH 序列Ssp Ⅰ酶切位点信息

由分析可见，有5 个物种的psbA-trnH 序列含 有Ssp Ⅰ酶切位点。在罗布麻属中，罗布麻psbAtrnH 序列含有Ssp Ⅰ位点，金平藤信息未知，包括白麻在内的其余5 个种均不含Ssp Ⅰ位点，由此可见罗布麻psbA-trnH 序列的Ssp Ⅰ酶切位点在罗布麻属中具有较高的种间特异性。

罗布麻属以外的其它属中，目前已知4 个属的物种中含有Ssp Ⅰ位点，但PCR 产物长度和酶切后片段长度均与罗布麻种差别较大，可以由电泳区分。但其它属种有很多种目前没有测序数据，因此在整个夹竹桃族中，罗布麻psbA-trnH 的Ssp Ⅰ酶切位点的特异性暂时未知。

4.2 酶切位点种内保守性分析

在NCBI 核酸数据库中，获得4 条罗布麻psbAtrnH 序列，分别为 KP152526.1、KP152527.1、KP152528.1、KT365818.1。本实验获得7 条罗布麻psbA-trnH 序列，一共有11 条序列，多序列比对结果表明，序列相似度高，长度基本一致且均在约228 bp位置有Ssp Ⅰ酶切位点，可见psbA-trnH 序列的SspⅠ酶切位点在罗布麻种内具有较高的保守性。

4.3 分子进化分析

用软件MEGA X[10]将“4.1”获得的16 条夹竹桃族不同种属psbA-trnH 序列构建进化树（邻接法），见图2。从进化树看出，大花罗布麻A.hendersonii voucher 和白麻A.pictum voucher 在进化树上处于同一位置，与《中国植物志》中将大花罗布麻和白麻合并统一为白麻的情况相一致。另外进化树也表明，与罗布麻属最近缘，易于混淆的品种为白麻，与市场上的混淆情况也相一致。

图2 夹竹桃族进化树

4.4 其它实验条件考察

本实验尝试了用20 mg 或者50 mg 液氮研磨的粉末均可以提取出总DNA，作为扩增模板时都可以得到明亮的条带，后续实验时为了保证药材在液氮研磨后尽快加入Buffer HS Ⅱ，便不再称量，用小量勺估计20～50 mg 的粉末直接加入准备好Buffer HSⅡ的EP 管中，均可以成功提取总DNA。PCR 扩增程序的退火温度设置在56 ℃、57 ℃、58 ℃时均可以有效扩增。所有批次样本扩增做了3 次重复，一次使用含普通Taq 酶的Mix，两次使用含高保真Taq酶的Mix，一共扩增63 批次，扩增成功率为100%。所有样本测序做了两次重复，一次为单向测序（测序引物为psbAF），一次为双向测序（测序引物为psbAF/trnHR），一共测序42 批次，全部得到合格的测序结果，测序的成功率为100%。

5 讨论

在干燥植物中，中药材DNA 提取难度较大，有的研究采用改良CTAB 法[11]，先去除多糖类成分，得到质量较高的DNA。本实验采用的TaKaRa 植物基因组DNA 小量纯化试剂盒，用ProtocolⅠ提取的DNA 无法成功进行PCR 扩增，用Protocol Ⅱ提取的DNA 均能成功扩增。液氮研磨需要尽量得到非常细致的粉末，56 ℃水浴时间可以稍延长，以提高DNA 得率。本实验的难点在于DNA 提取，高质量的DNA 是后续实验成功的保障。

基于罗布麻和白麻psbA-trnH 序列的22 bp 差异，曾尝试设计特异性引物，预期能扩增出罗布麻片段，不能扩增白麻片段；但试验了多对引物，均没有成功，于是改用PCR-RFLP 方法。

对于PCR-RFLP 法，由于其最终判定依据在于是否被酶切和酶切条带大小，因而考察的重点应该是酶切条件的种属特异性和种内保守性等。而对于扩增结果的影响因素如反应轮数、退火温度、酶、扩增仪器和试剂等的考察则不是那么重要[12]。本研究结合NCBI 核酸数据库中的测序数据和对本实验数据进行分析，罗布麻psbA-trnH 序列的种间特异性高，种内保守性高，理论上罗布麻与罗布麻属中的绝大部分物种都可以采用此法区分。在罗布麻属中，金平藤的序列信息未知，可以对金平藤的psbA-trnH区域进行测序分析，以进一步考察此方法的特异性。

目前，使用psbA-trnH 序列作为中药材DNA 条形码的研究越来越多，例如绵马贯众[13]、鼠曲草属植物[14]等，psbA-trnH 是否能够作为罗布麻的DNA 条形码仍有待研究。DNA 条形码鉴定方法需要进行测序，而大多数药品检验机构还不具备测序条件；如果只需要区分罗布麻和白麻，本实验建立的PCRRFLP 法比较快捷。

分子生物学方法是传统鉴定方法的有效补充[15]，除了DNA 条形码、PCR-RFLP 方法外，还有特异性荧光定量PCR，位点特异性PCR，snp 分子标记，HRM 技术[16～18]等。除了中药材，有研究表明很多的中药饮片也能够使用分子生物学方法进行有效鉴定[17]，对于中药粉末和含原粉的中成药进行鉴定也是可行的[18]，因为其检验的是物种的遗传物质，不会随药材的部位、状态的改变而改变；但要注意高温炮制等过程可能会破坏DNA。对于罗布麻叶片、复方罗布麻片等含有罗布麻叶原粉的中成药，可以进一步研究此PCR-RFLP 鉴别方法是否适用。