谷胱甘肽硫转移酶及乙醛脱氢酶基因多态性对环磷酰胺方案治疗膜性肾病的效果与不良反应的影响研究*

钱 卿，胡 楠**，周 华，凌 静，陈 荣，邹素兰，王莉英

常州市第一人民医院 1 药学部；2 肾内科,常州 213003

特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一种肾脏特异性的自身免疫性肾小球疾病，是成人肾病综合征最常见的病理类型之一[1]。一项研究分析了来自中国938 家医院71 151例患者的肾活检报告，其中膜性肾病的发病率为23.4%，仅次于IgA 肾病（28.1%）[2]。环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）联合糖皮质激素的治疗方案是“改善全球肾脏病预后（kidney disease improving global outcomes,KDIGO）”指南推荐的首选方案之一，其总体缓解率可达72%，10 年内的不透析生存率为89%[3]。然而，CTX 在不同患者个体间的疗效与不良反应仍存在显著的差异性，药物基因组学研究表明，可能与CTX 体内药动学过程相关的代谢酶和转运体的基因多态性有关。代谢酶主要涉及细胞色素P450（cytochrome P450，CYP）2B6、2C9、2C19、3A4、3A5，谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S transferases，GST）和乙醛脱氢酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等，转运体包括多药耐药相关蛋白4（multidrug resistance-associated protein 4，MRP4）和P-糖蛋白（P-gp）[4]。

本研究旨在探讨GST 和ALDH 基因多态性对CTX 方案治疗IMN 的效果与不良反应的影响，为精准治疗及药学监护提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2018 年1 月至2019 年12 月于本院肾内科行肾脏穿刺活检、病理诊断为膜性肾病，且采用CTX 方案的患者共计65 例。本研究经本院医学伦理委员会审批通过，所有患者均签署知情同意书。

纳入标准：肾脏病理明确诊断为膜性肾病的患者；治疗方案为糖皮质激素联合CTX 静脉冲击治疗，且疗程达到1 年及以上；开始CTX 方案治疗前3 个月未使用过其他免疫抑制剂。

排除标准：未严格遵循方案规律行CTX 冲击治疗的患者；改用其他免疫抑制剂的患者；疗程＜1 年无法评价疗效或不良反应的患者；有严重的心血管系统、呼吸系统、血液系统、肝脏疾病或癌症；无法控制的严重感染；妊娠、哺乳及有生育计划的育龄期女性；依从性差、随访不配合者；年龄＜18 岁。

1.2 用药方案

二联免疫抑制治疗采用中等剂量醋酸泼尼松片（0.5mg·kg-1·d-1）或等效剂量甲泼尼龙片口服，联合CTX（商品名：安道生，规格：0.2 g/支，Baxter Oncology GmbH 公司）每月静脉冲击治疗。CTX 方案为：①治疗开始的前6 个月：每月静脉冲击治疗一次，剂量为0.8g/次，即0.4 g CTX 溶于生理盐水250 mL 中，连续静滴2 天；②治疗6 个月后：根据患者病情改善情况，减量至每2～3 个月静脉冲击治疗一次，剂量为0.8 g/次，分2 天给予。

1.3 疗效及不良反应评价

疗效评价标准为：①完全缓解：24 h 尿蛋白定量＜0.3 g·d-1，血浆白蛋白正常（≥35 g·L-1），肾功能稳定；②部分缓解：24 h 尿蛋白定量0.3～3.5 g·d-1且低于尿蛋白基线值50%以上，血浆白蛋白≥30 g·L-1，肾功能稳定；③未缓解：24 h 尿蛋白定量≥3.5 g·d-1和（或）尿蛋白下降＜基线值50%。

不良反应评价标准参考美国国立癌症研究所《通用不良事件术语标准》（CTCAE v4.0），重点记录患者在治疗过程中发生的严重胃肠道反应、肝肾功能损伤、骨髓抑制、感染性疾病等不良反应。评判标准如下：胃肠道反应包括恶心、呕吐、腹痛或腹泻等；肝功能损伤：谷丙转氨酶、谷草转氨酶或总胆红素升高≥正常值上限1.5 倍（排除其他引起肝功能损害因素）；肾功能损伤：血清肌酐升高至＞正常值上限或基础值的1.5 倍以上；骨髓抑制：白细胞计数＜3.5×109/L 和（或）中性粒细胞计数＜1.5×109/L。

1.4 基因型分析

采用聚合酶链式反应（PCR）-直接测序法检测膜 性肾病患者GSTP1 A313G（rs1695）、ALDH3A1（rs2228100）的基因型，仪器采用美国Applied Biosystems 公司3730XL 型DNA Analyzer。

DNA 提取：取患者外周静脉血2 mL 置EDTA抗凝管中，按照全血基因组DNA 提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）说明书操作步骤提取DNA，并通过紫外分光光度法测定所提取基因组DNA 的浓度和纯度。

PCR 引物设计：采用Primer 5.0 软件设计扩增引物及测序引物，见表1。所有引物均由生工生物工程上海股份有限公司合成。

表1 聚合酶链式反应和延伸反应引物

扩增反应体系及条件：PCR 反应体系包括DNA 模板1 μL（约100 ng），上游引物及下游引物（10 pmol·μL-1）各1 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1）4 μL，rTaq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，加灭菌双蒸水至25 μL。rs1695 的PCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸5 min。rs2228100 的PCR 反应条件：95℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸40 s，共35 个循环，最后72 ℃延伸5 min。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。用χ2检验等位基因分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。在疗效影响因素的单因素分析中，分类变量采用非参数检验，连续变量如数值符合正态分布则采用单因素方差分析，不符合正态分布则采用非参数检验；在单因素分析中，有显著影响的因素进一步纳入多因素研究，多因素分析采用有序Logistic 回归。考察基因多态性对不良反应的影响，采用χ2检验或Fisher’s 精确检验，当预测频数＜5 时，采用Fisher’s精确检验，当预测频数≥5 时，采用χ2检验。

2 结果

2.1 一般资料

最终纳入65 例患者，男39 例，女26 例。患者治疗前的基础资料，尿蛋白定量（24 h）、血清白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）等检测指标见表2。

表2 膜性肾病患者的人口学统计资料及实验室指标

2.2 基因型及等位基因频率

GSTP1 rs1695 A 和G 等位基因的频率分别为74.62%和25.38%，ALDH3A1 rs2228100 C 和G 等位基因的频率分别为46.15%和53.85%。通过χ2检验，以上各基因型分布均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡（P＞0.05），研究资料具有群体代表性。

2.3 CTX 方案治疗膜性肾病的疗效影响因素分析

CTX 联合糖皮质激素方案治疗膜性肾病患者的总体缓解率达78.5%，其中完全缓解率为41.5%，部分缓解率为36.9%，而未缓解率为21.5%。在单因素分析中，逐个考察性别、年龄、体重、体重指数、治疗前24 h、治疗前ALB、治疗前BUN、治疗前SCr、GSTP1 和ALDH3A1 不同基因型对疗效的影响。结果显示，性别、体重、GSTP1 rs1695 基因型对疗效存在显著影响（P=0.003、P=0.032、P=0.047），见表3。

表3 12 个月疾病缓解率的单因素分析

将单因素分析中有显著影响的因素进一步纳入多因素分析，结果表明，女性患者出现部分缓解或未缓解的可能性显著低于男性患者（P=0.017），女性患者出现部分缓解或未缓解的可能性仅为男性患者的25.6%，故性别是12 个月疾病缓解率的独立影响因素。尽管GSTP1 rs1695 GG 型的疾病完全缓解率是AA 型的2.5 倍（75.00% vs 30.00%），但GSTP1 rs1695 基因型并非12 个月疾病缓解率的独立影响因素（P＞0.05），见表4。

表4 12 个月疾病缓解率的多因素分析

本次多因素分析的有序Logistic 回归通过了平行线检验（P=0.240），表明以上统计结果准确可靠。

2.4 GSTP1 和ALDH3A1 基因多态性与CTX 不良反应的相关性

65 例患者在1 年治疗观察期内，有12 例（占18.5%）出现肝功能异常；24 例（占36.9%）发生感染性疾病，其中13 例（占20.0%）发生呼吸道感染，13例（占20.0%）发生泌尿系感染，未发现有严重胃肠道反应和骨髓抑制其他不良反应。GSTP1 rs1695、ALDH3A1 rs2228100 位点的基因多态性与肝损伤或感染等不良反应之间无显著相关性。

3 讨论

在本研究中，CTX 联合糖皮质激素方案治疗IMN 患者12 个月时的总体缓解率达78.5%，其中完全缓解率为41.5%，部分缓解率为36.9%。

最近，Fernández-Juárez G 等[5]研究比较了糖皮质激素和CTX 的循环交替治疗方案与他克莫司和利妥昔单抗的序贯治疗方案、用于原发性膜性肾病诱导和维持治疗的有效性。结果显示，糖皮质激素和CTX 组在12 个月和24 个月时的总体缓解率（含完全缓解和部分缓解）分别为79.1%和83.7%，完全缓解率分别为32.6%和60.5%，均明显高于他克莫司和利妥昔单抗组。另一纳入21 项研究（1187 例）的荟萃分析显示，CTX 组在治疗6 个月和12 个月时的总体缓解率分别为64.7%和77.4%，6 个月时的缓解率低于钙调磷酸酶抑制剂（CNIs）组，但12 个月时的缓解率与CNIs 组无显著差异[6]。以上文献中CTX 方案的总体缓解率与本研究的结果较为一致。

单因素分析显示，性别对疗效存在显著性影响，多因素分析进一步证实男性是12 个月疾病缓解率的独立危险因素，即男性的疾病缓解率明显低于女性。其他研究也显示，性别（男性）、年龄、起病时肾小球滤过率（GFR）下降、低分子量生物标记物（如β2微球蛋白）分泌增加、治疗后磷脂酶A2 受体抗体（anti-PLA2R）水平持续升高，以及肾脏病理C3染色阳性是膜性肾病肾功能进展的危险因素[1]。Choi JY 等[7]筛选出的膜性肾病预后良好的预测因子包括起病时较高的血红蛋白（HR:0.82，95%CI：0.72～0.93），较高的血清白蛋白水平（HR:0.66，95%CI：0.44～0.99）以及较高的GFR 值（HR:0.96，95%CI：0.95～0.97）。

CTX 是一种前药，进入体内后经细胞色素CYP 2B6、2C9、2C19 等代谢酶转化为4-羟基环磷酰胺（4-OH-CTX），然后开环生成醛磷酰胺，两者处于相互转化的动态平衡中，最终转化为烷化剂磷酰胺氮芥和丙烯醛。4-OH-CTX 通过GSTM1/GSTP1/GSTT1 催化进一步与细胞内谷胱甘肽结合，生成无毒的水溶性复合物由尿液排出。醛磷酰胺可通过ALDH1A1和ALDH3A1 氧化生成为羧磷酰胺（CEPM）。因此，GST 和ALDH 的活性对CTX 的疗效和毒性反应具有非常重要的影响。

一项采用标准CTX 方案治疗不同自身免疫性疾病的研究显示[8]，GSTP1 I105V（rs1695）野生型（AA 型）的治疗有效率为21.42%，杂合子（AG 型）和纯合子（GG 型）的治疗有效率分别为61.53%和50.00%，野生型和突变型的疗效差异具有统计学意义（P=0.03）。其机制为GSTP1 突变型为弱代谢型，酶活性下降，导致CTX 活性代谢产物治疗浓度更高、作用维持时间更长，因此患者的治疗反应更佳。另有一项对乳腺癌和其他癌症患者的研究，其报道了GSTP1 I105V 基因多态性与CTX 为基础的方案的治疗反应之间有相关性，突变型（包括杂合子和纯合子）患者总体生存率更高及复发率更低[9]。

然而，也有部分研究得出了不同的结论。Wang HN 等[10]发现GSTP1 rs1695 基因型对狼疮性肾炎患者的疗效无显著影响（P=0.31）；但GSTA1*A 杂合子（CT 型）相对于野生型（CC 型）CTX 治疗后疾病不缓解的风险更大（P=0.005），原因是CTX 活性代谢产物（4-OH-CTX）体内暴露量低[AUC4OH-CTX：12.8（9.8，19.5）vs27.5（18.1，32.8）h·mg·L-1，P=0.023]。

Audemard-Verger A 等[11]在采用CTX 方案治疗狼疮性肾炎中探讨了GSTP 基因多态性对预后的影响，发现GSTP1 C313A（野生型）和C313A＞G（纯合子和杂合子）的总体缓解率分别为91.2%和72.4%（P=0.059），在多因素分析中，GSTP1 C313A＞G 是总体缓解率低的独立影响因子，OR 95%CI 为5.011（1.025～24.510），P=0.047。该研究推测的作用机制为GSTP1 主要表达在肾脏而非肝脏，即GSTP1 并不是参与CTX 代谢主要的关键酶，其突变型较低的缓解率是与肾脏的解毒作用有所降低有关。

基因多态性对CTX 药物不良反应的影响方面，陈玲燕等[12]研究发现，在相同剂量下，ALDH3A1 rs2228100 突变纯合子（GG）患者用CTX 后出现肝功能异常的风险显著高于CC/GC 患者OR 95%CI为20.59（2.26～187.96）。在本研究中，ALDH3A1 GG型肝损伤发生率约为CC 型的2 倍（16.7%vs7.7%），但无统计学差异，可能与研究方案中CTX 治疗剂量偏低以及样本量偏小有关，也未发现CTX 导致骨髓抑制和出血性膀胱炎的病例。

本研究的单因素分析结果显示，GSTP1 rs1695基因型对疗效存在一定影响，但多因素分析中未显示其为独立影响因素，可能与本研究的样本量较小有关，需要扩大样本量来进一步验证和探究，而ALDH3A1 rs2228100 基因型对疗效与不良反应无显著影响。