上调miR- 200a 通过抑制MACC1 影响结直肠癌细胞生物学行为的研究

邱丽浈，吴共发，刘钰君，曾宇婷，赖剑龙，李海刚

1.广州医科大学附属第四医院健康管理中心，广东广州 511300；2.广州医科大学附属第四医院病理科，广东广州511300；3.中山大学孙逸仙纪念医院病理科，广东广州 510120

该课题组前期研究显示，miR-200a 在结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）中表达下调[1]，具有高度转移能力的细胞表达最低，成瘤但不转移的细胞表达最高[2]，在CRC 细胞中下调miR-200a 能诱导细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），促进细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡[3]。结肠癌转移相关基因-1 （metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1）已经被认为可以作为结直肠癌侵袭转移和预后等的标志物。 前期研究证实，CRC 患者癌组织中高表达MACCl，MACCl 的高表达与CRC 发生淋巴结转移、神经侵犯和高级别临床分期密切相关[4-5]。目前，miR-200a 与MACC1 的关系未阐明， 该研究是在前期研究基础上，进一步探讨miR-200a 对CRC 细胞的作用及潜在机制。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

人结直肠癌细胞LoVo 购自中科院上海生命科学研究院。 miR-200a 的类似物mimics 及其阴性对照物negative control（NC）由上海吉玛公司设计并合成，序列为：mimicssense：5’-UAACACUGUCUG GUAACGAUGU-3’、anti-sense：5’-AUCGUUACCAGACAGU GUUAUU -3’；NCsense：5’ -UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3’、anti-sense：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。 RPMI-1640 培养基、胎牛血清、Opti-MEM 和阳离子脂质体LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司；兔多克隆浓缩型抗体MACC1（产品编号ab226803）购自英国abcam 公司；β-actin 抗体（sc-69879） 购自美国Santa Cruz Biotechnology 公司；过氧辣根酶标记抗兔IgG 购自中杉金桥；PVDF 膜购自美国Millipore 公司； 抗体稀释液购自福州迈新公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒、蛋白抽提试剂盒 （P0028）、BCA 蛋白浓度检测试剂盒（P0012）、SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒（P0012AC）、ECL 反应检测试剂盒（P0018S）均购自碧云天生物技术；Transwell板和各类培养板等购自美国Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组 LOVO 细胞培养液为含10%胎牛血清的RPMI-1640， 培养环境37℃、5%CO2培养箱，取生长状态良好且无污染的细胞进行实验。 实验分为3组，mimics 组（转染miR-200a mimics）、blank 组（转染空脂质体） 和NC 组 （转染miR-200a negative control）。 细胞转染方法及转染效率检测按照该实验组前期方法进行[1]。

1.2.2 细胞增殖能力检测 制作细胞悬液并计算细胞浓度，96 孔板的每个孔的细胞量为0.5×104，每孔的终体积100 μl/孔，mimics 组、blank 组和NC 组的每组均设置5 个复孔， 各组转染48 h 后进行CCK-8 检测，每孔加CCK-8 液10 μl，加样后的96 孔板避光，在细胞培养箱中孵育2 h，选择450 nm 波长，酶联免疫检测仪测定吸光光度值（OD 值），计算平均值。

1.2.3 同质性肿瘤细胞黏附实验 mimics 组、blank 组和NC 组细胞转染24 h 后，制作1×105个/mL 浓度的细胞悬液， 预铺各组细胞的96 孔板中相对应地加入100 μl 悬液， 放置在37℃、50 mL/L CO2浓度的培养箱中培养60 min，轻晃培养板后将所有液体吸到另外一块新96 孔板，PBS 轻洗2 次并将液体完全吸到新96 孔板。 将新96 孔板置于培养箱孵育30 min，待细胞沉淀在板底后于倒置显微镜下观察计数未黏附细胞数。同质性细胞黏附数=1×104-未黏附细胞数，实验设置3 个复孔。

1.2.4 细胞侵袭实验Matrigel 基质胶铺24 孔板上室， 接种2×104/mL 个/每孔的各组细胞悬液于上室，下室加入500 μl RPMI-1640。 把24 孔板放入细胞培养箱孵育30 h，PBS 洗去死亡悬浮细胞，将膜用甲醇浸泡固定20 min，浸泡在苏木素中染色5 min，PBS 清洗后用棉签擦去膜的内室面未穿膜的细胞，随机计数显微镜下5 个高倍视野的下室面膜细胞穿过数， 取平均值。

1.2.5 Western Blot mimics 组、blank 组和NC 组细胞转染48 h 后离心收集， 保存在-80℃冰箱备用。进行Western Blot 检测时，-80℃冰箱中取出样本，按试剂盒说明书进行蛋白提取并测定浓度，每个电泳孔的上样量均为40 μg， 使用SDS-PAGE 凝胶电泳法，蛋白转膜使用湿转法， 室温下用含5%脱脂奶粉的PBST 缓冲液封闭印迹膜1 h，加入MACC1 一抗（稀释度为1:1 000），4℃过夜孵育， 封口膜封盖防止干燥，次日上午洗膜，按1:5 000 稀释过氧辣根酶标记抗兔IgG 配制成工作液使用，室温条件下孵膜1 h，蛋白条带显影用ECL 化学发光法， 内对照为β-actin 蛋白。 使用Image J 软件对Western Blot 条带进行灰度值量化分析，蛋白相对表达量=灰度值目的蛋白/灰度值β-actin。

1.2.6 在线基因库数据库预测 应用网络数据库microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)预测miR-200a 和MACC1 的靶向关系。

1.3 统计方法

采用SPSS 25.0 统计学软件分析数据，计量资料用（±s）表示，比较采用t 检验；影响因素采用单向方差分析，组间比较根据方差齐性检验结果选择多重比较方法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组细胞增殖能力变化比较

CCK-8 法结果显示mimics 组的OD 值为（1.27±0.07），均显著低于blank 组的（1.75±0.04）和NC 组的（1.70±0.08）， 差异有统计学意义 （F=27.780，P<0.001），blank 组和NC 组差异无统计学意义 （P=0.599）。统计结果显示mimics 组细胞增殖能力显著减低。 见图1。

图1 过表达miR-200a 对LOVO 细胞增殖能力的影响

2.2 3 组同质性肿瘤细胞黏附力变化比较

mimics 组、blank 组和NC 组细胞的同质性肿瘤细胞黏附数量分别为 （1 241.33±76.42）、（1 021.00±62.00）和（994.67±53.78），差异有统计学意义（F=13.130，P=0.006）， 两两比较显示，mimics 组细胞黏附能力显著高于blank 组和NC 组， 差异有统计学意义 （P=0.006、0.003）。 blank 组和NC 组比较差异无统计学意义（P=0.636）。 见图2。

图2 过表达miR-200a 对LOVO 细胞同质性肿瘤细胞黏附力的影响

2.3 3 组细胞侵袭能力变化比较

mimics 组、blank 组和NC 组细胞的侵袭穿膜细胞数分别为 （54.20±6.83）、（85.6±6.39） 和 （88.00±5.52），3 组比较差异有统计学意义 （F=13.130，P=0.006）， 两两比较显示，mimics 组细胞侵袭穿膜数显著低于blank 组和NC 组， 差异有统计学意义 （P<0.001），blank 组和NC 组比较，差异无统计学意义（P=0.890）。 见图3。

图3 过表达miR-200a 对LOVO 细胞侵袭能力的影响

2.4 3 组细胞MACC1 的表达变化比较

Western Blot 条带使用Image J 软件读取灰度值，计算各组蛋白相对表达量，mimics 组、blank 组和NC组的MACCI 蛋白表达灰度值分别是（0.011±0.003）、（0.284±0.043）和（0.293±0.071），差异有统计学意义（F=32.084，P=0.001）。 两两比较显示，mimics 组的MACC1 表达量显著低于blank 组和NC 组，差异有统计学意义（P<0.001），blank 组和NC 组比较，差异无统计学意义（P=0.820）。

2.5 数据库分析结果

在线数据库分析显示，miR-200a 与MACC1 存在一定的互补碱基对，MACC1 是miR-200a 的潜在靶向基因。 见图4。

图4 miR-200a 和MACC1 互补的核苷酸序列

3 讨论

CRC 在世界范围内癌症的病死率中居第二位，虽然近年对CRC 这种疾病治疗干预方面已经取得新进展，但CRC 患者的病死率仍然很高。转移的形成是导致CRC 患者最终死亡的主要原因[6]，因此提高CRC患者存活率，寻找能评估转移形成的风险和预后的生物标志物， 识别疾病驱动因素的分子机制有助于为CRC 寻找新的治疗干预点。

大量研究报道显示，miRNAs 在生理过程如新陈代谢、细胞凋亡、分化和病理过程如肿瘤细胞增殖，细胞周期、 细胞凋亡、 侵袭乃至转移过程中极具效果，miRNAs 表达失调对恶性肿瘤（包括结直肠癌）的生长、侵袭、血管生成和转移具有重要关系[7-8]。 miR-200a 作为miR-200 家族成员之一，在CRC 中的表达失调及对侵袭转移的可能作用机制已经有文献报道，miR-200a 在CRC 中的作用类似抑癌基因的作用,其表达下调甚至缺失能促进CRC 的恶性进展[9-11]。 该研究基于前期研究开展进一步探讨实验， 研究结果显示，在CRC 细胞中过表达miR-200a 能抑制细胞的增殖和侵袭能力，增强同质性细胞黏附力，结果证实了过表达miR-200a 能增强癌细胞间黏附能力，使细胞间变得黏附增强不易迁移、减低癌细胞增殖和侵袭能力，说明miR-200a 具有抑制CRC 细胞恶性生物行为的作用，结果符合现有关于miR-200a 的报道[12]。

虽然miR-200a 对CRC 的作用及机制有报道，且不少研究证实miR-200a 能通过调控EMT 通路上的关键位点基因从而影响肿瘤生物学行为，例如Park 等[13]、Pichler 等[14]报道在CRC 细胞HCT116 中诱导miR-200家族成员的过表达能抑制肿瘤细胞的EMT 表型，但miR-200a 调控CRC 生物学行为的机制仍然有待深入。已经有强烈的证据支持MACC1 在CRC 中的异常高表达在肿瘤浸润转移、预后等发挥重要作用，可以作为CRC 转移、预后等预测和标志物的作用，是新的治疗靶点[15-16]。 该研究组前期也报道MACC1 在CRC中的高表达与侵袭转移及不良预后有关，是恶性进展的促进基因[17]。在肝癌中已经证实miR-200a 通过靶向MACC1 抑制肝癌细胞迁移侵袭并能作为预后靶标[18]。目前CRC 中miR-200a 和MACC1 的关系未见报道。综合文献分析和数据库分析， 研究推测在CRC 中，miR-200a 可能通过靶向调控MACC1 影响癌细胞的生物学行为。 该研究实验结果显示， 上调miR-200a表达后，MACC1 表达显著减低，在线数据库分析显示miR-200a 与MACC1 存在一定的互补碱基对，MACC1 是miR-200a 的潜在靶向基因。该研究虽然没有用荧光素酶报告实验证实miR-200a 与MACC1 的直接靶向关系， 但依据肝癌中mir-200 能靶向调控MACC1 文献报道[18]，可以推测出在CRC中，过表达miR-200a 通过靶向下调MACC1 表达抑制人CRC 细胞的增殖能力和侵袭能力，增强细胞黏附力。

综上所述，过表达miR-200a 可以明显抑制癌细胞增殖和侵袭能力， 增加癌细胞同质性黏附能力，最终阻遏CRC 细胞的恶性生物学行为表型， 机制是通过靶向调控抑制MACC1 实现的， 但miR-200a 和MACC1 的直接靶向关系及调控恶性行为的作用机制有待进一步研究以明确。