COL4A1 在口腔鳞状细胞癌中的表达及临床意义

熊子鋆，李丹苹，李萍,

1.广西医科大学第一附属医院病理科，广西南宁 530021；2.广西医科大学附属口腔医院病理科，广西南宁 530021

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，其发病可占口腔癌病例的90%[1-2]。 尽管近年在OSCC 的诊疗方面取得了一定的进展，但是目前OSCC 的治疗方式仍然是以手术为主，放疗、化疗为辅[3-4]。口腔鳞状细胞癌有易转移，易复发的特点，5 年生存率一直停滞在40%～50%左右[5]。 Ⅳ型胶原蛋白(type Ⅳcollagen protein，Col-IV)是由COL4A1-COL4A6 基因编码的α链组成[α1(Ⅳ)-6(Ⅳ)]，是构成组织基底膜（basement membranes, BMs）的主要成分。 肿瘤细胞突破基底膜向周围及远隔器官发生侵袭和转移过程中，可能伴随着Ⅳ型胶原蛋白的表达改变[6]，然而其分子机制尚不明确。 因此，该文通过收集2017 年6 月—2020 年5月广西医科大学附属口腔医院的38 对OSCC 及癌旁样本进行免疫组化实验以及联合TCGA 及GEO 数据库中OSCC 样本的研究数据进行综合分析，研究COL4A1 基因在OSCC 中的表达情况以及及其与OSCC 发生、发展的相关性，为OSCC 的诊断、治疗及预后的改善提供新的思路，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源

1.1.1来源于公共数据库的OSCC 基因表达数据从肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库(http://www.cancergenome.nih.gov/)的头颈部肿瘤数据中筛选出肿瘤类型符合口腔鳞状细胞癌的mRNA 数据进行下载，其中包括310例OSCC 和30例非癌对照样本。 另外，从美国国立生物技术信息中心NCBI 的GEO 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中检索OSCC 相关的研究。 从检索到的OSCC 相关研究中剔除重复和不可获取基因表达数据的研究，并筛选出样本来源于人类，包含OSCC 和正常对照样本的基因芯片数据。并将GEO 数据中相同平台的表达谱数据通过R 包去批次效应后合并成一组数据，合并后共得到18 个基因芯片表达谱数据组，其中包含730例OSCC 与325例正常对照样本。

1.1.2免疫组织化学染色实验样本选取广西医科大学附属口腔医院保存的38 个口腔鳞癌病例的OSCC与癌旁组织蜡块标本作免疫组化实验。 38 个病例中包括男性25例，女性13例；年龄26～79 岁，中位年龄53 岁。 按TNM 分期标准，T1 期6例、T2 期18例、T3 期7例、T4例7例。 淋巴结转移患者21例，无淋巴结转移患者17例。 病理分级按照WHO 分级标准，高分化23例，中到低分化15例。 病例纳入标准:①病理已确诊为口腔鳞状细胞癌并有相同组织标本切缘经病理确认为阴性的癌旁组织作为对照；②临床资料相对完整；③排除合并其他原发性恶性肿瘤的患者。

1.2 方法

1.2.1从公共数据库数据中提取COL4A1 基因表达数据进行统计分析使用R 语言软件从来源于公共数据库数据的OSCC 的mRNA 数据以及基因芯片表达谱数据组中提取出COL4A1 的基因表达数据，并对未标准化的数据进行log2 处理，用于后续进行COL4A1 基因在OSCC 中表达情况的统计分析。

1.2.2免疫组织化学染色采用免疫组织化学SP 法。将OSCC 和癌旁组织蜡块切片、烤片后于二甲苯中脱蜡；在浓度梯度为100%、95%、85%、75% 的乙醇中水化后用无菌蒸馏水洗涤。 使用EDTA（PH9.0）抗原修复15 min(高压法)，冷却后蒸馏水清洗3 次，加入内源性过氧化物酶阻断剂反应10 min。 PBS 清洗后用COL4A1(GeneTexGTX130215,1:100)多克隆抗体进行一抗孵育，4℃冰箱孵育过夜。次日早上37℃恒温箱复温10～15 min，PBS 洗涤3 次后加入山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，37℃恒温箱孵育20 min，PBS 洗涤后利用DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)显色1～2 min，苏木精复染，1%盐酸酒精分化1～2 s，返蓝液返蓝5 s；自然晾干后10%中性树胶封片。

1.3 观察指标

公共数据库数据用于比较分析OSCC 样本与非癌样本的COL4A1 基因表达水平的差异。免疫组化实验结果用于验证OSCC 样本与癌旁样本中COL4A1的蛋白表达水平差异。对免疫组化染色结果的判断采用半定量的免疫反应性评分系统进行评分。由两位专业研究人员在高倍镜(400)下，每张切片随机选择4 个视野进行观察，并以双盲的形式单独打分。 评分规则:①染色强度:无染色计0 分；弱染色(淡黄色或黄色)计1 分；中等强度染色(棕色)计2 分；强染色(深棕色)计3 分； ②阳性细胞所占百分比:＜5%计0 分；5%～25%计1 分；25%～50%计2 分； 50%～75%计3 分；＞75%计4 分；③总得分:染色强度得分乘以染色比例得分为总得分。

1.4 统计方法

1.4.1基因芯片数据的统计分析使用SPSS 25.0 统计学软件进行数据分析，计算COL4A1 在OSCC 组织和非癌组织中的表达差异，并绘制ROC 曲线，计算约登指数。 基因表达结果用（±s）表示，采用独立样本t检验。 把约登指数作为截断值（cut-off），以超过临界值的癌样数为真阳性数，以超过临界值的非癌样数为假阳性数。 接着使用Stata 14.0 统计学软件进行Meta分析，绘制森林图和总ROC（SROC）曲线。 当SMD＞0且95%置信区间不与无效直线相交时，认为OSCC 组织中COL4A1 的表达高于非癌组织。使用I2统计方法分析数据集之间的异质性。 如果P＜0.05 或I2＞50%则被认为数据集之间存在异质性，将使用随机效应模型来合并数据，不存在异质性则采用固定效应模型。 均为双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。 另外，为了验证Meta 分析结果的可信性，对纳入研究进行发表偏倚检验和敏感性分析。

1.4.2免疫组化结果的统计分析免疫组化评分结果的统计分析使用SPSS 25.0 统计学软件进行，癌与癌旁样本组的分值统计结果采用（±s）表示，两组的比较采用配对t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。 并按免疫组化评分结果将OSCC 样本进行分组，免疫组化总得分＜6 分为低表达组，≥6 分为高表达组，采用χ2检验比较不同临床病理参数下OSCC 组织中COL4A1 高表达组与低表达组的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 公共数据库统计分析结果

通过对公共数据库纳入研究的COL4A1 在OSCC 和正常对照组织中的表达值进行统计分析，结果表明TCGA 以及GEO 的11 个基因表达谱数据中COL4A1 在OSCC 的表达水平高于非癌组织，差异有统计学意义 （P＜0.05）。 公共数据库纳入研究及COL4A1 表达值结果见表1。为了得出全面的结论，对TCGA，GEO 数据进行了Meta 分析。 因异质性检验显示P＜0.05 且I2大于50%，采用了随机效应模型进行分析。 森林图结果显示OSCC 中COL4A1 表达水平显著高于非癌组织，是OSCC 风险因子(SMD =1.697，95% CI:0.187 ～2.206，P ＜0.001；I2=89.0% ，P ＜0.001，图1A)。 接着对结果可信性进行了验证，Begg检验P=0.327，绘制漏斗图显示基本对称，Egger 检验P=0.059（图1B)，结果均无明显发表偏倚(P＞0.05)。 敏感性分析结果显示剔除任一研究，合并效应量均未发生明显变化，表明Meta 分析的结果比较稳定可信。 为了进一步确定COL4A1 区分癌症和非癌组织的能力，进行了ROC 和SROC 曲线分析。 根据TCGA、GEO 数据绘制ROC 曲线，计算出约登指数定为截断值（cutoff），以超过临界值的癌样数为真阳性数，以超过临界值的非癌样数为假阳性数,计算并绘制出SROC 曲线（ 图1D）。 SROC 的AUC 为0.960 （95% CI：0.940 ～0.970）,COL4A1 的敏感性、特异性、阳 性 似然比（PLR）、阴性似然比（NLR）、诊断比值比（DOR）分别为0.900（95%CI：0.820～0.940）、0.920（95%CI：0.840～0.960）、10.600（95%CI：5.500～20.400）、0.110（95%CI：0.060～0.210）和93.000（95%CI 38.000～230.000）。 以上结果证明，COL4A1 的表达在OSCC 中明显升高，且有较好地区分癌与非癌组织的能力。

表1 公共数据库纳入研究及COL4A1 表达值（±s）

表1 公共数据库纳入研究及COL4A1 表达值（±s）

纳入研究年份（年）平台口腔鳞癌例数 COL4A1 表达值正常对照例数 COL4A1 表达值t 值 P 值GSE34105 GSE34106 GSE21866 GSE51010-GPL201 GSE30784 GSE31853-GPL570 GSE51010-GPL570 GSE74530 GSE78060 GSE9844 GSE138206 GSE23558 GSE46802-GPL6480 GSE85195 GSE3524 GSE31853-GPL96 GSE146483 GSE107591 GSE10121 GSE13601 GSE19089 GSE25099 GSE31056 GSE36090-GPL2986 GSE37991 GSE46802-GPL8490 GSE56532 GSE75538 GSE75539 TCGA 2012 2012 2014 2014 2011 2011 2014 2017 2017 2008 2019 2011 2013 2017 2005 2011 2020 2017 2008 2008 2009 2011 2011 2012 2013 2013 2014 2016 2016 GPL14951 GPL201 GPL570 GPL6480 GPL96 GPL17077 GPL6244 GPL6353 GPL8300 GPL6947 GPL5175 GPL10526 GPL2986 GPL6883 GPL8490 GPL10739 GPL18281 GPL10904 90 50 231 71 24 8 17 35 31 3 57 23 13 40 6 10 14 7 310 13.095±0.413 9.391±0.690 11.133±0.958 2.533±0.821 4.462±3.483 9.432±2.352 8.538±1.231 2.467±1.144 10.919±0.709 10.371±0.563 8.806±0.498 12.038±0.730 0.554±0.859 12.354±0.168 0.165±0.170 9.357±0.612 11.750±1.567 11.743±0.391 14.293±1.254 31 3 89 16 5 3 1 6 6 2 6 3 2 2 24 3 40 10 6 14 8 30 12.428±0.529 7.912±0.585 7.895±0.996 1.316±1.098 2.693±0.761 7.961±0.220 6.910±0.582 2.691±1.887 9.325±1.073 10.614±1.291 7.038±0.519 10.041±1.101-0.304±1.891 11.326±0.430 0.060±0.012 8.155±0.867 11.141±0.866 9.501±0.623 11.489±1.583 7.194 3.625 26.786 5.021 1.115 1.749 4.901-0.400 6.482-0.300 13.971 7.297 0.768 14.064 1.510 3.262 1.273 8.190 11.405＜0.001 0.001＜0.001＜0.001 0.275 0.122＜0.001 0.691＜0.001 0.779＜0.001＜0.001 0.517＜0.001 0.191 0.006 0.217＜0.001＜0.001

图1 基于公共数据库的COL4A1 表达值的Meta 分析

2.2 COL4A1 在OSCC 组织和癌旁组织中的蛋白表达情况

在该研究选取的38例OSCC 患者中，OSCC 细胞呈阳性表达，癌旁组织主要在上皮细胞基底层有阳性表达。 OSCC 与癌旁组织免疫组化染色结果见图2。OSCC 组织平均染色计分为(5.368±2.387)分，癌旁组织为(3.342±1.632)分，差异有统计学意义(t=4.978,P＜0.001)。 χ2检验提示OSCC 组织中COL4A1 蛋白表达水平的高低在不同年龄、性别、分期、分化程度以及淋巴结转移情况的临床病理参数下差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

图2 COL4A1 在OSCC 与癌旁组织免疫组化染色结果（放大倍数100x）

表2 COL4A1 蛋白低表达和COL4A1 蛋白高表达的临床病理参数对比

3 讨论

肿瘤的侵袭和转移过程包括：肿瘤细胞从原发部位突破基底膜渗入血管腔，经血管运输到远处器官形成微转移灶，并在转移部位继续增殖，其中涉及了诸多复杂的分子生物学过程。 OSCC 易发生局部浸润性和淋巴结转移的特点是影响口腔鳞癌患者预后的重要因素[7]。目前癌症研究发现，癌细胞分子水平的变化会对组织水平的变化产生影响，并可能在驱动癌症的发生、发展中起关键性的作用[8]，研究口腔鳞癌发生、发展的分子机制正是改善其预后的关键。

Ⅳ型胶原蛋白作为细胞外基质基底膜结构的主要成分，是由3 条α 链形成的异源三聚体。 其中，由COL4A1 编码的α1 链参与构成的α1α1α2 异源三聚体是Ⅳ型胶原蛋白的主要构成类型，普遍表达于各种成熟组织的BM 中。 基底膜与肿瘤关系密切，上皮细胞的基底膜是阻止肿瘤细胞向周围侵袭的物理屏障，血管内皮的基底膜阻碍了肿瘤细胞进入血管腔发生远处转移[9]。 肿瘤微环境中胶原蛋白的降解重塑导致的基底膜改变会促进肿瘤侵袭、转移，而肿瘤的发生、发展也会引起胶原蛋白以及基底膜变化[10]。 该研究中通过对来源于公共数据库的1 040例OSCC 样本以及355例非癌样本的COL4A1 基因表达数据进行Meta 分析来比较OSCC 与非癌样本中COL4A1 基因表达水平的差异,结果显示OSCC 中COL4A1 基因的表达水平高于非癌组织（SMD＞1,P＜0.05)，验证了COL4A1 基因在OSCC 中表达上调。 另外，对38 对OSCC 与癌旁样本进行了免疫组织化学染色实验。 通过对免疫组化染色结果进行半定量评分以及统计分析发现，COL4A1 在OSCC 组织中的蛋白表达(5.368±2.387)分高于癌旁组织(3.342±1.632)分(P＜0.05)，验证了COL4A1 基因的高表达同样导致其蛋白表达水平在OSCC 中表达上调。 除该文的研究外，在另外一项针对OSCC 基因表达谱的研究中也发现了COL4A1基因在OSCC 中高表达，通过对15 对OSCC 与癌旁样本进行分析，结果显示COL4A1 基因在OSCC 中的表达水平高于癌旁组织，其中OSCC 组织对比癌旁组织的COL4A1 基因表达水平的平均差异倍数为7.971倍，其研究结果与该研究结果都同样验证了COL4A1基因在OSCC 中表达上调[11]。 COL4A1 在OSCC 中的表达上调可能会引起细胞外基质以及基底膜结构、成分的改变，从而影响OSCC 的发生、发展，提示了COL4A1 可能是其潜在的分子标志物，可能在OSCC的诊断、治疗以及预后监测方面具有一定的临床价值。该研究中对公共数据库来源的COL4A1 基因表达数据进行ROC 与SROC 曲线分析的结果提示，COL4A1 在OSCC 中的高表达使其具有较好的区分癌与非癌组织方面的能力，可能对OSCC 有一定的诊断意义。

COL4A1 在OSCC 中的表达上调对OSCC 发生、发展的作用虽然目前尚不明确，但是在其他肿瘤的研究中已发现COL4A1 的高表达对有肿瘤有促进的作用[12]。例如，在肝癌的研究中发现，COL4A1 基因以及蛋白表达水平在肝癌组织中显著高于非癌组织，并且肝癌组织COL4A1 表达水平的增高促进了肝癌细胞的增殖和迁移[13]。 在乳腺癌中也发现COL4A1 蛋白表达水平相对于非癌组织显著增高，且乳腺癌组织的COL4A1 蛋白表达水平与肿瘤的转移呈正相关，提示了肿瘤组织中COL4A1 表达上调可能对肿瘤的转移有促进作用[14]。 而在肿瘤细胞的分化方面，也有研究发现COL4A1 参与编码的Ⅳ型胶原蛋白的表达量与OSCC 细胞的分化程度呈正相关性，分化程度越高的OSCC 细胞其Ⅳ型胶原蛋白的含量就越高[15]。 因此推测，COL4A1 在OSCC 中的表达可能与OSCC 的分期、淋巴结转移以及细胞分化程度等临床参数相关。为了验证这一推测，将免疫组化实验得到的OSCC 样本的COL4A1 蛋白表达水平与其临床参数相结合进行分析，结果未能发现COL4A1 蛋白的表达水平与OSCC患者的淋巴结转移、肿瘤分期以及分化程度之间存在关联（P＞0.05）。 但是不排除结果受到了纳入研究的病例数较少、研究病例来源较单一以及患者自身的民族、地域、生活习惯等因素的影响。未来可考虑扩大样本例数和病例选择范围做进一步研究。

另外，在目前热门的肿瘤侵袭转移相关机制研究中，上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)已被发现可以导致细胞迁移、侵袭和抗凋亡能力的增强，并且在EMT 过程中会出现细胞外基质成分生成显著增加以及与基质金属蛋白酶（MMP）激活有关的胶原蛋白重塑[16]。 MMP 是一个大家族，可以降解包括Ⅳ型胶原蛋白在内的细胞外基质的大部分成分[17]。 有研究发现，MMP-2 和MMP-9 表达的下调可以抑制EMT 的活化并降低了OSCC 迁移和侵袭的能力，同时它们还被认为与肿瘤的晚期阶段、转移和低生存率密切相关[18-19]。 COL4A1 在OSCC 中的表达上调对OSCC 的作用和影响可能与EMT 以及MMP 参与的分子生物学过程有关。对与EMT、MMP 相关的分子作用机制的研究，未来可以作为进一步探讨COL4A1 的表达在OSCC 中的作用的一个方向。

综上所述，COL4A1 的基因和蛋白表达水平在OSCC 中均表达上调，提示了其有可能是OSCC 潜在的生物分子标志物，对OSCC 诊断、治疗的提高以及预后的改善具有一定的临床意义，值得后续进一步研究。