人参皂苷Rh2诱导肝癌细胞Hep G2自噬与凋亡的分子机制研究

高涵，吴琦，陈宏月，郭红艳，周涛，刘哲丞

1.齐齐哈尔医学院生物化学与分子生物学教研室，黑龙江齐齐哈尔 161006；2.齐齐哈尔医学院附属第一医院普通外科，黑龙江齐齐哈尔 161041

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）简称肝癌，是目前临床上最常见的癌症之一[1]。肝癌严重威胁人类的健康，其发病率和病死率也在不断增加，在全世界，每年肝癌的新发病率居恶性肿瘤中的第5位，病死率居第3位。因此，植物的抗癌成分越来越受到人们的极大关注。人参皂苷（ginsenoside）是人参的主要活性成分之一，在癌症的预防和治疗中被极度重视和广泛研究，然而人参皂苷对癌症的作用机制是十分复杂的[2]。人参皂苷Rh2包括20(S)和20(R)两种构型，20（S）-人参皂苷Rh2比20（R）-人参皂苷Rh2更具有显著的抗癌作用，能够抑制细胞增殖并且引起人肝癌HepG2细胞G1期阻滞[3]。20（R）和20（S）人参皂苷Rh2都具有抗癌作用[4],并且使得caspase-3活性增强，诱导肝癌HepG2细胞凋亡。目前，肝癌的病因及发病机制尚未完全阐明，但从肿瘤细胞学来看，肝癌发生的本质在于细胞增殖与凋亡的调节失控[5]。近年来中药的抗癌机制研究取得了很大进展，尤其对肝癌细胞增殖周期的调控与诱导细胞凋亡两方面内容[6]。该研究旨在观察人参皂苷Rh2与肝癌细胞的自噬和凋亡，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

肝癌HepG2细胞由哈尔滨医科大学生物化学与分子生物学实验中心馈赠。20（S）-人参皂苷Rh2由齐齐哈尔医学院分子生物学实验室分离制备。胎牛血清的DMEM培养液（Hyclone公司，美国）、粉（Gibco公司，美国），0.25%EDTA（吉诺生物医药技术有限公司）。兔抗鼠caspase-8/9、beclin-1、LC3（Santa Cruz公司）。Cy3荧光抗体、FITC抗体（康威试剂公司）。倒置荧光显微镜（Olympus）。

1.2 细胞培养

使用含10%胎牛血清、丙酮酸钠（20 000 U/L）、谷氨酰胺（20 000 U/L）、青霉素（200 000 U/L）和链霉素（0.02 g/L）的培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱内培养肝癌HepG2细胞，隔天换液，用胰蛋白酶消化后进行传代。

1.3 免疫荧光实验

用不同浓度的20（S）-人参皂苷Rh2作用于肝癌HepG2细胞后，HepG2细胞用95%乙醇室温下固定10 min，使用PBS清洗3次。加入1 mL的0.1%TritonX-100于培养皿中，室温下处理10 min，PBS清洗3次。将1 mL的1%BSA加入培养皿，37°C封闭1 h。将兔抗鼠caspase-8/9和beclin-1、LC3蛋白抗体按照1:200稀释滴加在样品上，放入4°C冰箱过夜。加入荧光Cy3或FITC标记的二抗，4°C冰箱过夜。加入DAPI染色液（1:500稀释）室温孵育5 min，用PBS清洗。通过荧光显微镜（Olympu）观察HepG2细胞并拍照。每个实验至少重复3次。

2 结果

为了进一步证实20（S）-人参皂苷Rh2对自噬相关基因Beclin-1和LC3表达的影响，以及caspase-8介导的膜受体途径和caspase-9介导的线粒体途径，从而诱导HepG2细胞凋亡的作用机制，将20μg/mL的20（S）-人参皂苷Rh2作用于HepG2细胞，作用不同时间，分别用caspase-8/9抗体、自噬相关基因Beclin-1和LC3抗体，做双染色免疫荧光分析。荧光Cy3标记caspase-8/9抗体，二抗对应一抗；荧光FITC标记LC3和Beclin-1抗体，二抗对应一抗。

20（S）-人参皂苷Rh2作用HepG2细胞3 h后，HepG2细胞caspase-8的活性和Beclin-1的荧光强度表达水平显著升高。见图1。

图1 20（S）-人参皂苷Rh2作用于HepG2细胞3 h caspase-8活性与Beclin-1表达的关系(×200)

20（S）-人参皂苷Rh2作用HepG2细胞3 h后，HepG2细胞caspase-9的活性和LC3的荧光强度增强，且两者相近，说明caspase-9活性和LC3表达无显著变化。见图2。

图2 20（S）-人参皂苷Rh2作用于HepG2细胞3 h caspase-9活性与LC3表达的关系(×200)

3 讨论

肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程，涉及多因素、多基因的变化，多阶段、多步骤的演变[7]。迄今为止，肝癌的病因和发病机制尚未充分阐明。从肿瘤细胞学来看，肿瘤的发生不仅与加速度肿瘤细胞增殖有关，而且与抑制肿瘤细胞死亡密切相关[8]。经过100多年的研究，人们将细胞的死亡方式分为两类：非程序性细胞死亡和程序性细胞死亡 （programmed cell death，PCD）。非程序性细胞死亡称为坏死（necrosis），它是细胞被动死亡的过程，在大多数情况下不受细胞信号转导的控制[9]。程序性细胞死亡不同于坏死，坏死主要由细胞内基因组的调节，其最重要的形态学特征是细胞膜和核膜的完整性。目前，研究表明，程序性细胞死亡（PCD）包括细胞凋亡和自噬性细胞死亡两类，自噬引起的细胞死亡称为Ⅱ型PCD，凋亡称为Ⅰ型PCD[10]。

促进肿瘤细胞死亡是治疗肿瘤的方法之一。随着自噬研究的深入，自噬在肿瘤发生、发展和消亡中的作用越来越受到关注[11]。在抗癌药物的基础研究和临床应用中充分认识并合理利用肿瘤的自噬、凋亡和溶酶体阳性因子，调整肿瘤细胞自身的死亡机制[12]，有助于弥补甚至突破现有抗肿瘤药物的缺陷和不足，促进肿瘤研究及其相关学科的共同发展。

肿瘤是最早发现的与自噬有关的疾病之一[13]，自噬的异常调节与肿瘤的发生发展有关。目前，参与自噬调控的基因被命名为自噬相关基因（autophagy related gene，ATG），进化比较保守[14]。自噬过程的调控机制非常复杂，至今尚未完全阐明。Beclin-1和LC3是自噬相关蛋白编码的基因。目前关于自噬与肿瘤关系的研究已引起人们广泛关注，但关于自噬与肝癌的报道却很少。熊燚[15]研究显示在其通路中细胞色素C从线粒体释放到细胞浆中与胱天蛋白酶-9（caspase-9）结合形成凋亡体，激活caspase-9后进一步激活caspase-3，进而诱导细胞凋亡。还有报道，人参皂苷Rh2通过上调肝癌细胞SK-Hep-1中促凋亡蛋白激酶（PKC）活性可有效促进细胞色素C从线粒体释放并且激活caspase-3，促进线粒体信号转导，从而促进肝癌细胞凋亡[15]。研究发现,抗癌药物可以激活JNK通路，通过激活上游肿瘤细胞自噬转录因子c-Jun和Beclin-1蛋白表达水平[16]。

生物学发展研究证实，凋亡作为调控机制在多细胞生物的正常发育中起着重要的作用。病理学研究显示，细胞凋亡是许多疾病的基础，细胞凋亡和逃逸是肿瘤发生和发展的重要机制之一。细胞凋亡是由基因控制的细胞活动，诱导肿瘤细胞凋亡是一种重要机制。caspase是一种高度保守的丝氨酸蛋白酶，以酶原的形式存在于细胞质中，经两次切割后被激活，细胞凋亡依赖于caspase的活化。caspase根据不同的分子结构和功能可分为：caspase-l/4/5/13/14，主要参与炎症反应；caspase-2/8/10，参与caspase级联反应的启动过程；caspase-3/6/7，是凋亡的直接执行者。蛋白酶家族中与凋亡相关的酶主要是caspase-8、caspase-9和caspase-3等，它们的激活主要是通过膜受体途径和线粒体途径介导[17]。

该研究旨在进一步探讨肝癌的发生、发展及人参皂苷Rh2是否通过调节自噬相关基因Beclin-1和LC3的表达而诱导凋亡，将20μg/mL人参皂苷Rh2作用于HepG2细胞不同的时间，然后进行免疫荧光分析。研究结果显示，与对照组HepG2细胞相比，20（S）-人参皂苷Rh2作用组Beclin-1在1～4 h内明显升高（P＜0.05），但LC3在各时间点的表达无明显变化（P＞0.05）。通过免疫荧光分析，人参皂苷Rh2作用3 h后，caspase-8活性明显升高，Beclin-1表达水平明显增强，荧光标记的LC3表达无明显变化。以上实验证实，人参皂苷Rh2诱导HepG2细胞凋亡的作用主要通过膜受体途径调节caspase-8实现，或可能与Beclin-1的表达有关，其作用有时间依赖性。然而，通过电子显微镜观察结果，只有典型的细胞凋亡的特点，在第一、二期有典型急性左心衰合并肺感染诊断标准的凋亡小体；在第三、四期自噬过程中形成的凋亡体和吞噬体未见。因此，人参皂苷Rh2诱导HepG2细胞凋亡的作用是否与自噬有关，还有待进一步的实验和研究。