LncRNA H19对类风湿性关节炎的影响及作用机制

林 晓，丁 晨，朱 伟，朱晓冬

(牡丹江医学院免疫教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

LncRNA H19是最早被鉴定的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)之一，其在许多生理和病理学过程中发挥广泛生物学功能[1]。研究显示,LncRNA H19在炎症反应[2]、自身免疫病[3]、血管老化和肿瘤生物学[4]中具有重要功能作用。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节病变为主的慢性炎症性自身免疫性疾病[5]。课题组前期研究表明，LncRNA H19对RA患者巨噬细胞极化有调控作用。本研究旨在探讨LncRNA H19对关节炎模型鼠的影响及其可能存在的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂AAV8(和元生物，中国上海)，CFA(Sigma公司)，Trizol试剂盒、逆转录试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)；H19、TNF-α、CCL-2、CCR-7PCR引物(生工合成)；RIPA裂解液(北京碧云天公司)，蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂(北京碧云天公司)，PVDF膜(Millipore公司)，IRF5抗体(Santa Cruz公司)，p-IRF5抗体(affinity公司)。

1.2 动物模型与分组将24只清洁级雄性C57BL/6小鼠(6～8周龄，购自牡丹江医学院实验动物中心；所有动物实验均已通过牡丹江医学院伦理委员会批准)，在室温控制在20 ℃左右无菌的SPF动物房饲养，自由饮水，进食标准的小鼠饲料。按随机数字表法分为4组：Normal组，AIA组、AIA+AAV8-CMA组、AIA+AAV8-CMV-H19组，每组6只。异氟烷麻醉小鼠，Normal组在左侧踝关节周围皮下注射30 μL生理盐水；其余组在相同位置注射30 μL含结核分枝杆菌的弗氏完全佐剂(CFA)诱导佐剂性关节炎；AIA+AAV8-CMA组建模前3周，向AIA小鼠踝关节注射5 μL腺相关病毒(AAV8)空载，作为AAV8过表达LncRNA H19对照组；AIA+AAV8-CMV-H19组建模前3周，向AIA小鼠模型踝关节注射5 μL携带H19的AAV8过表达LncRNA H19；8 d后，处死小鼠收集踝关节标本。

1.3 关节肿胀程度的判定使用足趾容积测量仪，分别在建模前1 d以及建模后每天检测一次小鼠的足和踝关节体积，连续检测8 d，与Normal小鼠踝关节体积变化比较观察体积变化(△体积=造模后体积-造模前体积)。

1.4 组织病理学染色(HE染色)颈椎脱臼处死小鼠后，取小鼠踝关节，4%多聚甲醛固定，10 %EDTA脱钙两个月。制成6 μm厚的石蜡切片，置60 ℃烘箱4 h脱蜡，二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ分别浸泡5 min，无水酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精分别浸泡3 min，放入苏木素染色3 min，水洗3遍后1%盐酸酒精分化12 s，自来水冲洗返蓝20～30 min，0.5%伊红水溶液复染10 min，水洗3遍；再次使用梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片，在光学显微镜下观察小鼠关节部位炎症病变程度。

1.5 RNA提取和RT-qPCR按照Trizol试剂盒的操作流程提取踝关节组织处总RNA，超微量核酸蛋白测定仪测纯度及含量(A260/A280大约为1.8～2.0)。采用反转录试剂盒，按照说明书进行cDNA链合成，然后按照PCR反应试剂盒说明书进行PCR扩增。反应条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环，以GAPDH为内参，RT-qPCR引物序列为：

表1 PCR中的引物序列

1.6 Western blotting将收集的踝关节处滑膜组织充分研磨，加入含有1%蛋白酶抑制剂苯基甲基磺酰氟的RIPA裂解缓冲液，提取总蛋白，在10% Bis-Tris凝胶上分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上，在室温下5%脱脂牛奶封闭1 h后，将膜与一抗在4 ℃孵育过夜，并轻轻摇动。然后，将膜与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下温育1.5 h，加显色液，凝胶成像看条带，用图像处理软件Image.J对目的蛋白条带灰度值进行定量分析。

1.7 统计学分析用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析。数据采用“均数±标准差”表示，两样本数据采用t检验分析两组之间差异，并对两组以上差异进行方差分析，以P<0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠踝关节和足部肿胀随时间变化情况与AIA组相比，自建模后第一次检测肿胀体积开始AIA+AAV8-CMV-H19组肿胀程度明显高于AIA组、AIA+AAV8-CMA组，差异具有统计学意义(P<0.01)，n=6。

表2 小鼠踝关节和足部肿胀体积变化量

2.2 HE染色观察各组小鼠踝关节处病理变化HE染色显示，Normal组小鼠踝关节组织未见明显病理性改变；与Normal组比较，AIA组、AIA+AAV8-CMA组小鼠关节滑膜明显增生，炎性细胞浸润，水肿明显；AIA+AAV8-CMV-H19组可见大量炎性细胞浸润，水肿十分显著，如图3所示。

图1 HE染色观察各组小鼠踝关节病理变化(×40)

2.3 小鼠踝关节处LncRNA H19及炎症相关因子mRNA表达情况荧光定量PCR检测LncRNA H19的表达，与Normal组相比，AIA组、AIA+AAV8-CMA组H19表达明显升高，AIA+AAV8-CMV-H19组升高最显著；检测各组炎症相关因子mRNA的表达，与AIA+AAV8-CMA组相比，AIA+AAV8-CMV-H19组H19、TNF-α、CCL-2、CCR-7表达显著上升，具有统计学意义(P<0.01)，n=6，见表3、图2。

图2 LncRNA H19过表达促进IRF5磷酸化

表3 荧光定量PCR检测H19、TNF-α、CCL-2、CCR-7结果

2.4 LncRNA H19对关节炎模型鼠组织中IRF5表达的影响Western blot结果显示，各组IRF5表达情况无显著差异，但p-IRF5表达情况各组差异显著，与Normal组相比，AIA组、AIA+AAV8-CMA组p-IRF5表达量均有不同程度升高，与AIA+AAV8-CMA组相比，AIA+AAV8-CMV-H19组p-IRF5表达量明显升高，明可能存在LncRNA H19过表达促进IRF5磷酸化，差异具有统计学意义P<0.01，如图4所示。

3 讨论

RA是一种慢性自身免疫性疾病,其发病机制复杂，没有明确的治疗方法。对于RA的研究普遍集中在其发病的免疫调节过程及相关免疫细胞。长链非编码RNA是一类长度大于200 bp且不能翻译成蛋白质的RNA分子。越来越多的研究证实，LncRNA与RA的滑膜细胞持续增生、抑炎因子、促炎因子之间平衡破坏有密切关系[6]。LncRNA H19作为最早被鉴定的长链非编码RNA之一，其在许多生物学过程中发挥重要功能。已有研究表明，LncRNA H19在RA患者中表达异常[7]，并对巨噬细胞极化有重要调节作用，其过表达促进M1型巨噬细胞极化，加重炎症病情[8]。巨噬细胞是引发类风湿关节炎的重要细胞，其大量存在于RA患者的软骨组织和滑膜细胞中。免疫调节异常也是RA发病的重要因素，其中炎性因子和趋化因子的失衡在RA病情进展中起关键作用；有研究显示，敲低LncRNA H19，使IL-1β，TNF-α和IL-6等炎症因子表达下调[9]。在胆管炎中，胆管细胞衍生的外泌体LncRNA H19诱导趋化因子CCL-2和IL-6的表达和分泌[2]。我们通过对关节炎模型鼠转染携带LncRNA H19的AAV8来过表达LncRNA H19，RT-qPCR结果显示，LncRNA H19过表达上调炎症因子TNF-α、CCL-2、CCR-7mRNA表达；HE染色检测踝关节处炎症病变加重，与RT-qPCR结果一致，发现LncRNA H19过表达加重关节炎模型病情，与前期报道一致。

IRF5是调节免疫系统活动的重要转录因子，通过调控炎症因子和趋化因子的表达，在自身免疫性疾病中起免疫调节作用[10]。临床研究发现，RA患者IRF5表达量低于正常对照组[11]，并且在RA的发病过程中调控IFN-α、IFN-β、IL-6、TNF等炎症因子的表达[12]，另外，IRF5的表达受miR-125b[13]、miR-125a[14]、miR-22-3p[15]抑制后，可促进M2巨噬细胞极化，减缓炎症；研究还发现，在转染H19的巨噬细胞中，IRF5的表达量增加。基于上述研究，我们检测了关节炎模型中IRF5及p-IRF5的表达情况，Western blot结果显示，LncRNA H19过表达促进IRF5磷酸化。证实了LncRNA H19过表达加重关节炎病情，可能与IRF5有关。

综上所述，LncRNA H19可能通过调控IRF5磷酸化，加重关节炎模型病情，但是涉及的详细的调控机制还仍不清楚，有待进一步研究。