基于网络药理学探讨玉屏风散治疗系统性红斑狼疮的作用机制

赵珈华，刘 洋，桂金秋，李福娟，李亚彤，鄂志野，石学魁，唐小云

(牡丹江医学院 1.病原生物学教研室；2.病原生物学实验室；3.免疫学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)

网络药理学是由英国邓迪大学的Hopkins于2007年首次进行系统阐述，阐述网络药理学是在系统生物学基础上，通过对生物系统多视点网络分析，选取特定信号靶点进行多靶点药物分析，主要强调通过基因靶点对信号通路的多途径调节，提高药物的治疗效果[1-2]。中药方剂通过君臣佐使的配伍原则，由两味及以上的中药药材组成。中药所含成分复杂，多个有效成分组和疾病多个靶点相互作用可能是其治疗疾病的主要作用机理[3-4]。方剂中的有效成分通过作用于疾病中多个靶点，调控多条信号转导通路，各有效成分配伍配合、相互协同，从而达到治疗效果。

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种除有典型皮肤损伤外并累及全身多系统多脏器的自身免疫性疾病，好发于女性，发病机制目前尚未明确。目前的治疗手段常以激素和免疫抑制剂为主，虽然可改善病人的症状及预后，但是不良反应及副作用较多，严重影响病人的生活质量[5]。

玉屏风散出自元代医学家朱震亨的《丹溪心法》，现收入于《中华人民共和国药典》以及《国家基本药物目录》[6-7]。《丹溪心法》记载，玉屏风散常用来治疗表虚自汗，易感风邪者。方剂方歌中也有“玉屏组合少而精，芪术防风鼎足行”之说。玉屏风散只有黄芪、白术、防风三味药组成，其中黄芪为君药，白术为臣药，防风为佐药[6]。根据《国家基本药物目录》所记载，目前玉屏风散为颗粒剂[7]。近些年随着玉屏风散在免疫学方面的深入研究，发现其具有提高机体免疫以及抗过敏的作用，因此临床上常将其用于治疗反复上呼吸道感染、支气管哮喘、过敏性鼻炎、荨麻疹、湿疹、带状疱疹等疾病[8-9]。

本研究通过网络药理学方法构建“中药-成分-靶点-疾病”网络，分析玉屏风散治疗SLE的活性成分及相应作用靶点，探讨其可能的治疗作用机制，为实验进一步的研究及临床应用打下一定的基础。

1 资料与方法

1.1 玉屏风散有效成分及靶点的筛选采用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[10]分别输入玉屏风散的组成药物黄芪、白术、防风，检索玉屏风散当中药物的所有药效化学成分，根据口服生物利用度(Oral bioavailability，OB≥30%)以及化合物类药性(Drug likeness，DL≥0.18)筛选玉屏风散的有效成分，并利用TCMSP 检索获得的活性成分，获取其有效成分对应靶点。通过Active Perl(版本5.26.1)脚本利用UniProt 数据库(https://www.uniprot.org)对靶点基因进行标准基因名称注释。即为玉屏风散有效成分与作用靶点。

1.2 SLE相关基因靶点的筛选将“Systemic Lupus Erythematosus”作为检索词，通过OMIM数据库(https://omim.org/)、GeneCards 数据库(https://www.genecards.org)、TTD数据库[11](http://db.idrblab.net/ttd/)检索SLE的相关基因靶点，并对检索的SLE相关靶点基因取并集，删除重复值。

1.3 玉屏风散-SLE“中药-成分-靶点-疾病”可视化网络的构建通过Bioinformatics & Evolutionary Genomics平台的Draw Venn Diagram工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)将SLE基因靶点与玉屏风散基因靶点取交集，得到Venn图和交集靶点信息文本。将玉屏风散活性成分与其对应靶点信息文本和SLE基因与玉屏风散基因交集靶点信息文本导入Cytoscape(版本3.7.2)构建玉屏风散-SLE“中药-成分-靶点-疾病”网络。

1.4 玉屏风散-SLE的PPI网络构建、核心基因筛选将玉屏风散有效成分的SLE靶点基因文本导入String数据库平台(http://string-db.org)，选择“Multiple proteins”，设置物种为“Homo sapiens”，其余参数保持默认值设置，构建蛋白互作网络(Protein-protein interaction network，PPI)，将String平台分析结果导出的string_interactions.tsv文件导入Cytoscape(版本3.7.2)筛选玉屏风散-SLE的核心基因。

1.5 玉屏风散-SLE基因富集分析将筛选出来的交集关键靶点基因通过RStudio(版本1.4.1103)选用R包(clusterProfiler包)进行GO基因富集分析和KEGG 通路富集分析，并分别使用R语言命令绘制出两种富集分析的柱状图和气泡图，以探讨玉屏风散有效成分对SLE靶点蛋白在基因功能及信号通路中的作用。

1.6 统计学方法使用RStudio(版本1.4.1103)通过R包(Bioconductor包)对GO富集分析以及KEGG富集分析数据分别进行处理，设置PvalueCutoff=0.05、QvalueCutoff=0.05为显著性差异限定值。

2 结果

2.1 玉屏风散活性成分以及靶点筛选在TCMSP数据库中分别输入黄芪、白术、防风，将OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件后，共得到化合物成分45个，对应的靶点714个。应用UniProt数据库对靶点基因进行标准化注释，最终得到活性成分39个(表1)，相应靶点基因216个。

表1 玉屏风散活性成分表

2.2 SLE相关基因靶点的筛选通过OMIM、GeneCards、TTD数据库选用“Systemic Lupus Erythematosus”作为检索词，检索到SLE相关基因分别为544个、4379个、29个。对GeneCards数据库中检索结果进行再筛选，选中其中RelevanceScore>5的SLE基因，GeneCards数据库筛选结果为2650个。将检索到的所有SLE相关基因进行去除重复值处理，最终得到SLE相关基因靶点2043个。

2.3 玉屏风散-SLE“中药-成分-靶点-疾病”网络的构建应用Bioinformatics & Evolutionary Genomics平台的Draw Venn Diagram工具对SLE基因靶点与玉屏风散有效成分基因靶点取交集，得到玉屏风散-SLE共同靶点124个(见表2、图1)。

表2 Draw Venn Diagram分析玉屏风散-SLE靶点统计表

图1 SLE相关靶点与玉屏风散有效成分作用靶点的Venn图

应用Cytoscape软件(版本3.7.2)，将124个玉屏风散-SLE共同靶点构建“中药-成分-靶点-疾病”的网络模型(图2)。结果显示，玉屏风散的38种有效成分协同作用于124个SLE靶点，其中槲皮素(MOL000098)拥有最多的对应靶点，达98个；山柰酚(MOL000422)、汉黄芩素(MOL000173)、7-O-甲基异丁香酚(MOL000378)、刺芒柄花素(MOL000392)、异鼠李素(MOL000354)、beta-谷甾醇(MOL000358)分别含有44、28、26、24、23、18个靶点，其余成分的对应SLE靶点均小于18个。说明槲皮素等可能在SLE治疗过程中起到关键作用，反映了玉屏风散治疗SLE的多成分、多靶点的特点。

图2 “中药-成分-靶点-疾病”网络图

2.4 玉屏风散-SLE的PPI网络构建、核心基因筛选在String数据库构建124个共有靶点的PPI网络，共124个靶点和2532条连线参与了PPI 网络，2532条连线代表了蛋白之间相互作用。将String数据库分析结果的string_interactions.tsv文件导入Cytoscape(版本3.7.2)，应用软件tools中的Network Analyzer对文件数据进行可视化分析(图3)。应用RStudio(版本1.4.1103)分析string_interactions.tsv，绘制玉屏风散-SLE关键靶点基因-邻接基因连线数目柱状图(图4)。基因与邻接基因连线的数目越多，越可能为网络调控核心基因，说明其在网络中的作用越大，很可能是玉屏风散药效发挥的关键靶点。

图3 Cytoscape分析PPI网络

图4 玉屏风散-SLE关键靶点基因-邻接基因连线数目柱状图

2.5 玉屏风散-SLE的GO功能富集分析选用R语言的clusterProfiler 工具包[12]，将GeneSymbol 转换为geneID，并对获取的基因进行GO 富集分析，以P<0.05 &Q<0.05进行筛选，获取156个GO 条目，排名前20的条目信息见表3。结果显示，玉屏风散-SLE靶点主要富集在细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、核受体活性、配体激活转录因子活性、泛素样蛋白连接酶结合、激酶调节活性等方面。

表3 GO功能富集分析信息表

2.6 玉屏风散-SLE的KEGG通路富集分析选用R的clusterProfiler 工具包[12]，将GeneSymbol 转换为geneID，并对获取的基因进行KEGG通路富集分析，以P<0.05 &Q<0.05筛选出168条信号通路，排名前20的通路信息见表4。结果显示，玉屏风散-SLE靶点主要富集于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、脂质与动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)、流体剪应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、乙型肝炎(Hepatitis B)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、前列腺癌(Prostate cancer)、肿瘤坏死因子信号通路(TNF signaling pathway)、小细胞肺癌(Small cell lung cancer)、查加斯病(Chagas disease)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等信号通路，提示玉屏风散有效成分可能通过多条信号通路发挥对SLE的治疗作用。

表4 KEGG通路富集分析潜在相关通路靶点表

3 讨论

玉屏风散是中医学中的常用经典方剂，由黄芪、白术、防风组成，是补气固表的代表方剂。研究表明玉屏风散中以刺芒柄花素、毛蕊异黄酮苷、槲皮素等成分为主[13]，这与本研究中构建的中药-成分-靶点-疾病的网络模型结果相吻合。

SLE是一种多因素系统性自身免疫性疾病，可累及皮肤、关节、中枢神经系统或肾脏等多个器官。尽管已发现激素、环境和遗传因素与SLE发病有关，但该病的发病机制仍需要进一步的探索。目前对SLE治疗常以激素和免疫抑制剂为主，但不良反应较多[5]。而中药具有多成分、多靶点的特点，其作用机制也更为复杂。

本研究中主要借助网络药理学方法、各数据库平台以及R的相关数据包工具，探讨了玉屏风散对SLE的治疗作用机制的预测研究。结果表明，玉屏风散和SLE的交集基因共124个。GO 功能富集分析表明差异基因富集的生物学功能、途径以及细胞定位主要涉及细胞因子活性、受体配体活性、信号受体激活剂活性、核受体活性、配体激活转录因子活性、激酶调节活性、丝氨酸水解酶活性、神经递质受体活性、丝氨酸型内肽酶活性、G蛋白偶联神经递质受体活性、蛋白激酶调节活性、丝氨酸型肽酶活性等；主要参与的生物过程有细胞因子受体结合、肿瘤坏死因子受体超家族结合、DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、泛素样蛋白连接酶结合、蛋白酶结合、泛素蛋白连接酶结合、血红素结合、作用于成对供体和分子氧的掺入或还原过程、整合素结合、四吡咯结合过程等。

KEGG 富集通路分析表明168条通路与SLE发病显著相关，目前研究较为广泛的主要是肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、IL-17 信号通路、磷酸肌醇3激酶(PI3K-Akt)信号通路、TH17细胞的分化、Toll 样受体(TLR)信号通路。TNF信号通路中的 TNF-α 与特异性受体结合，可以激活多条信号通路，调控细胞凋亡或存活、诱发炎症反应等作用。TNF-α是重要的促炎因子，参与细胞运动、细胞周期以及细胞凋亡等各个阶段。赵媛等[14]通过检测SLE患者外周血IL-17、TNF-α等细胞因子发现SLE活动期患者、SLE非活动期患者的IL-17和TNF-α水平均高于健康人，SLE活动期患者的IL-17和TNF-α水平高于非活动期患者，提示IL-17和TNF-α在SLE患者外周血中存在高表达,且随着病情活动度增强而升高。Th17 细胞归属于CD4+T 细胞亚群，可以分泌IL-17、IL-17F、IL-21 等细胞因子，IL-17[15]、IL-21[16]被证明在自身免疫病中具有关键作用。IL-17是炎性细胞因子，其调控的下游靶基因功能广泛，主要涉及细胞凋亡、胞外菌免疫、炎症反应、宿主防御、自身免疫等。曹景宏等[17]应用ELISA及流式细胞术测定SLE患者外周血Th17细胞和Treg细胞百分比以及IL-17的表达水平时，发现SLE活动期病人中Th17细胞、Th17/Treg百分比和IL-17表达水平显著高于SLE稳定期病人，提示Th17细胞、Treg细胞、IL-17的变化对观察SLE病人的疗效具有重要的临床意义。PI3k/Akt 信号通路是由膜受体酪氨酸酶激活启动的，参与多种生物学过程，调控细胞凋亡、免疫T 细胞的增殖与活化。代玉芳等[18]研究发现PI3K/AKT抑制剂能够阻断羟氯喹导致的SLE患者外周血单个核细胞(PBMC)凋亡，提示羟氯喹能够通过PI3K/Akt信号通路促进SLE患者体外PBMCs的凋亡。TLR信号通路是人类模式识别受体家族中最具特征性的信号转导通路，可识别检测多种病原体相关的分子模式，可激活相关信号通路，激发免疫细胞发生免疫反应，诱导皮肤炎症。范俊等[19]研究SLE应用复方新诺明联合泼尼松治疗对外周单个核细胞TLR7和TLR9表达的影响发现SLE病情变化情况与TLR9、TLR7基因转录呈正相关，提示TLR9、TLR7与SLE病情发展相关。通过PPI网络、GO、KEGG分析可以看出玉屏风散通过多靶点调控多通路发挥对SLE的治疗作用。

综上所述，本研究通过网络药理学的方法探讨玉屏风散对SLE治疗作用的有效成分、相关靶点及相关信号通路，为进一步研究玉屏风散对SLE的治疗作用机制提供了一定的理论基础，为玉屏风散的进一步临床应用提供科学依据。