地黄苦苷元对多囊卵巢综合征模型大鼠卵巢功能的影响*

韩体微，袁凤玲，王艳鹏，曾 彬

（1.中国人民解放军联勤保障部队第九八一医院妇产科，河北 承德 067000；2.河北省唐山市妇幼保健院生殖遗传科，河北 唐山 063000）

多囊卵巢综合征（PCOS）是女性不孕症的主要原因，其特征为性激素失衡（高雄激素血症），常伴高胰岛素血症、胰岛素抵抗（IR）等代谢疾病［1］。60%～70%的PCOS 患者会出现葡萄糖代谢异常［2］。二甲双胍为治疗2 型糖尿病常用降糖药，可恢复PCOS 患者的排卵，降低循环雄激素水平及流产和妊娠糖尿病的风险［3］。同时，激素疗法可能引起卵巢过度活化，但缓解代谢改变的效果欠佳［4］。六味地黄丸中的地黄苦苷元具有雌激素样活性，能与雌激素受体ERα 和GPR30 结合，调节下丘脑-垂体-卵巢轴而抑制促黄体生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）的分泌［5］。研究表明，磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）／ 细胞外信号调节激酶（ERK）通路参与了葡萄糖代谢异常的调控［6］。同时，ERK 缺陷型模型小鼠颗粒细胞（次级卵泡）的增殖减少，成熟卵泡量的减少，闭锁卵泡的增加，均会导致生育力下降［7］。本研究中探讨了地黄苦苷元对PCOS 模型大鼠卵巢功能的改善作用及其机制，为地黄苦苷元治疗PCOS 提供了理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：ASP300S 型组织脱水机、EG1150 型包埋机、RM2255 型全自动轮转切片机（德国Leica 公司）；CX43 型显微镜（日本Olympus 公司）；TCX1 -FMQ9013 型放射免疫分析仪（北京中西远大科技有限公司）；ELITE 200 型电泳仪、E -Blotter 型湿转仪（美国Wealtec 公司）；Gls 型数码凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）；CFX96Touch 型实时荧光定量PCR 仪（美国BD 公司）。

试药：地黄苦苷元（河南中医药大学，批号为135447-39-1，含量为95%）；二甲双胍（中国深圳中联药业有限公司，批号72106064）；来曲唑（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号22009132）；羧甲基纤维素（广州逸明化工有限公司，批号为177317-30-5）；苏木素染色液（上海碧云天生物技术研究所，批号为C0107）；大鼠空腹胰岛素（FINS）、睾酮（T）、LH、FSH 放射免疫检测试剂盒（中国原子能同位素研究所，批号分别为07451228，0670R95，0452R72，0592R90）；RIPA 裂解液（生工生物工程＜上海＞有限公司，批号为P0028）；PI3K、蛋白激酶B（PKB，又称AKT）、ERK、β-actin 和山羊抗鼠IgG 二抗（武汉艾美捷科技有限公司，批号分别为A1937，A1427，A0356，A2140，A0281）；Trizol 试剂盒（美国Qiagen 公司，批号为DD421）；mRNA 反转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒（美国Promega 公司，批号分别为RR047A，TK08045）；

动物：6 月龄雌性SD 大鼠50 只，购自山东大学实验动物中心，体质量（200±20）g，实验动物生产许可证号SCXK（鲁）2020-0013，动物合格证编号2020051786。在温度为（23±2）℃，相对湿度为60%～70%，光照12 h明暗交替的环境中饲养1 周后进行实验。

1.2 分组及建模

将50 只大鼠分为对照组（A 组）、模型组（B 组）、二甲双胍组（C 组），以及地黄苦苷元低、高剂量组（D1组、D2组），各10 只。A 组大鼠用1%羧甲基纤维素灌胃（10 mg／kg），其余各组大鼠用等量0.1 mg／mL来曲唑灌胃，每日1 次，连续21 d，以复制PCOS 大鼠模型。灌胃第7 天开始，每天取大鼠阴道分泌物，碱性美蓝染液染色，若阴道脱落细胞连续10 d 呈角化状态，且检测胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）＞2.8，证明模型复制成功。建模成功后，C 组灌胃二甲双胍（270 mg／kg）［8］，D1组、D2组大鼠灌胃地黄苦苷元50mg／kg 或，200mg／kg［9］，A 组和B 组大鼠灌胃等体积0.9%氯化钠溶液，均每日1 次，连续21 d。

1.3 观察指标

卵巢组织病理形态学：末次给药后，麻醉大鼠，分离卵巢组织。卵巢组织经脱水、包埋、切片（3 μm），苏木素-伊红（HE）染色，中性树胶封固，在显微镜观察大鼠卵巢组织病理形态学变化。

血液学指标：本次给药禁食12 h 后麻醉大鼠，心脏采血。测定FINS 及空腹血糖（FBG）水平，计算HOMAIR（HOMA-IR ＝FBG×FINS／22.5）；采用放射免疫法测定T，LH，FSH 水平。

mRNA 水平：取卵巢组织，Trizol 法提取总RNA，逆转录为cDNA 后扩增，反应体系体积20 μL，反应条件为95 ℃预变性30 s、95 ℃预变性5 s；60 ℃扩增44 s，40 个循环；61 ℃采集荧光。以β-actin 作为内参，采用2-△△Ct法计算PI3K，AKT，ERK mRNA 的相对表达量。

蛋白水平：取卵巢组织，研碎后加入RIPA 裂解液，冰浴2 h，12 000 g 离心10 min，取上清液，进行电泳（30 μg／孔），将印迹转移到聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，清洗3 次，将膜与PI3K（1 ∶300）、AKT（1 ∶400）、ERK（1 ∶400）、β-actin（1 ∶1 000）抗体4 ℃孵育过夜，回收一抗，清洗3 次将膜与山羊抗鼠IgG（1∶5000）在室温下孵育30 min，显色，采集图像并分析，以β-actin作为内对照。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 卵巢组织病理形态学

A 组大鼠卵巢结构正常，可见各期卵泡、成熟卵母细胞、黄体，细胞层呈粗大颗粒状，排列紧密；B 组大鼠多数卵泡严重闭锁，闭锁卵泡直径增大，颗粒细胞层被挤压，排列稀疏，甚至消失。C 组、D1组、D2组，闭锁卵泡的数量明显减少，次级卵泡黄体数量增加，颗粒细胞层增厚且聚集紧密。详见图1。

图1 大鼠卵巢组织病理形态学（HE，×40）Fig.1 Histopathology of rat′s ovary（HE，×40）

2.2 血浆FBG，FINS，HOMA-IR 水平

与A 组比较，B 组大鼠血浆FBG，FINS，HOMA-IR水平均明显升高（P ＜0.05）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组大鼠上述指标水平均明显降低（P ＜0.05），且D2组降幅低于D1组。详见表1。

表1 各组大鼠血浆中FBG，FINS，HOMA-IR水平比较（X±s，n＝10）Tab.1 Comparison of plasma FBG，FINS and HOMA-IR levels of rats in each group（± s，n ＝10）

表1 各组大鼠血浆中FBG，FINS，HOMA-IR水平比较（X±s，n＝10）Tab.1 Comparison of plasma FBG，FINS and HOMA-IR levels of rats in each group（± s，n ＝10）

注：与A 组比较，a P ＜0.05；与B 组比较，b P ＜0.05。下表同。Note：Compared with those in group A，a P ＜ 0.05；compared with those in group B，b P ＜0.05，as well as the following tables.

2.3 血清T，LH，FSH 水平

与A 组比较，B 组大鼠血清T、LH 和FSH 水平均明显升高（P ＜0.05）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组大鼠上述指标水平均明显降低（P ＜0.05），且D2组降幅低于D1组。详见表2。

表2 各组大鼠血清中T，LH，FSH 水平比较（± s，n ＝10）Tab.2 Comparison of serum T，LH and FSH levels of rats in each group（± s，n ＝10）

表2 各组大鼠血清中T，LH，FSH 水平比较（± s，n ＝10）Tab.2 Comparison of serum T，LH and FSH levels of rats in each group（± s，n ＝10）

2.4 卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平

与A 组比较，B 组大鼠卵巢中PI3K 和AKT mRNA表达水平明显降低，ERK mRNA 表达水平明显升高（P ＜0.05）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组大鼠卵巢中PI3K 和AKT mRNA 表达水平明显升高，ERK mRNA 表达水平明显降低（P ＜0.05），且D2组变化幅度大于D1组。详见表3 和图2。

表3 各组大鼠卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平比较（± s，n ＝10）Tab.3 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK mRNA in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

表3 各组大鼠卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平比较（± s，n ＝10）Tab.3 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK mRNA in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

图2 各组大鼠卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 的mRNA 水平Fig.2 The expression levels of PI3K，AKT and ERK mRNA in ovarian tissues of rats in each group

2.5 卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 蛋白表达水平

与A 组比较，B 组大鼠卵巢组织中PI3K 和AKT 蛋白表达水平均明显降低，ERK 蛋白表达水平均明显升高（P ＜0.05）；与B 组比较，C 组、D1组、D2组大鼠卵巢中PI3K 和AKT 蛋白表达水平均明显升高，ERK 蛋白表达水平明显降低（P ＜0.05），且D2组变化幅度大于D1组。详见表4。

表4 各组大鼠卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 蛋白表达水平比较（± s，n ＝10）Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK protein in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

表4 各组大鼠卵巢组织中PI3K，AKT，ERK 蛋白表达水平比较（± s，n ＝10）Tab.4 Comparison of expression levels of PI3K，AKT and ERK protein in ovarian tissues of rats in each group（± s，n ＝10）

3 讨论

PCOS 主要表现为激素（T 和LH）水平紊乱，IR 增强［10］。既往也有胰岛素增敏剂（如二甲双胍或罗格列酮）可减轻PCOS-IR 发生的报道［11］。但PCOS 患者多患有高胰岛素血症、IR 和其他代谢性病理症状，并非全部适合使用二甲双胍治疗［12］。

六味地黄丸可通过调节下丘脑-垂体-性腺轴，降低雄激素水平并诱导排卵［13］。同时，IR 和葡萄糖代谢异常在PCOS 患者中很常见，地黄对IR 的作用可能还归因于B 细胞功能的改善，这直接与胰岛素分泌有关［14］。因此，作为地黄主要活性成分的地黄苦苷元可能对PCOS 具有一定治疗作用。本研究结果显示，地黄苦苷元可降低PCOS 模型大鼠血清中T，LH，FSH，HOMA-IR水平，同时减少闭合卵泡的数量，增加黄体数量，增厚颗粒细胞层，其治疗PCOS 的效果堪比二甲双胍，临床应用前景广阔。

作为调节代谢的重要途径，PI3K／ERK 通路也是将PCOS 与IR 连接的关键途径［15］。PI3K／ERK 通路是胰岛素作用的主要转导途径之一，而PI3K／ERK 通路的改变与糖尿病、肥胖症和其他代谢性疾病中的IR 密切相关［16］。作为跨膜胰岛素受体蛋白，胰岛素受体底物-1（IRS-1）具有双向调节位点（丝氨酸和苏氨酸残基），丝氨酸的过度磷酸化对随后的PI3K／ERK 通路产生负调节作用［17］。AKT 作为PI3K／ERK 通路的下游靶蛋白，是调节能量代谢的重要因子，在促进糖异生中起着至关重要的作用。PI3K 激活可导致AKT 从细胞核转移到细胞质中，从而增强AKT 的转录活性［18］。研究显示，PCOS-IR患者子宫内膜的IRS-1 水平显著升高［19］。IRS-1（S307）的磷酸化升高导致PI3K／ERK 通路功能障碍，随后调节了葡萄糖转运子4 的转运，破坏了葡萄糖稳态，这是PCOS-IR 模型大鼠HOMA-IR 指数升高的原因［20］。在PCOS-IR 模型大鼠中，颗粒细胞中卵巢颗粒细胞特异性表达基因CYP19A1 的表达降低与血清T，LH，FSH 的广泛上调和雌激素的下调有关。雌二醇和FSH 水平的降低一定程度下调了AKT，进一步促进了PCOS-IR 模型大鼠的多囊发育［21］。考虑到PI3K／ERK通路在PCOS 与IR 连接中的重要性，可望通过阻断治疗药物的信号转导来缓解PCOS-IR。PI3K／ERK 通路相关基因的缺失可能导致卵巢早衰甚至不孕。AKT 在卵巢发育中起关键作用，密切参与FSH 诱导的颗粒细胞分化，影响卵巢颗粒细胞的增殖和卵泡发育［22］。在AKT 缺陷小鼠中，继发性颗粒细胞增殖和成熟卵泡减少，闭锁卵泡增加，延长了小鼠的发情周期，最终导致其不孕［23］。本研究结果显示，地黄苦苷元能升高PI3K 和AKT 蛋白及mRNA 的表达水平，同时降低ERK 蛋白及mRNA 的表达水平。

综上所述，地黄苦苷元可减轻PCOS 模型大鼠的胰岛素抵抗，恢复卵巢形态，其机制可能与调控PI3K／ERK 通路有关。