基于适配体的纳米金比色法快速检测微囊藻毒素-LR研究

吴袁袁 冯俊丽,2,*

(1 浙江工商大学海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州 310012)

微囊藻毒素(microcystins，MCs)是由铜绿微囊藻、念珠藻、鱼腥藻等产生的一类单环七肽结构的天然毒素，常存在于蓝藻水华污染严重、富营养化的水体中[1-3]。目前发现MCs存在90多种异构体，其中微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR)是水体环境中最常见、毒性最强、危害最大的一类肝毒素，其化学性质稳定、耐强酸强碱，在高温300℃条件下仍能长时间保持不被分解[1-3]。MC-LR毒性主要作用于肝脏细胞，可专一抑制蛋白磷酸酶的活性，使得肝细胞发生形变坏死，从而造成肝脏出血，肝功能丧失[2]。肾脏是MC-LR另一个重要的靶器官[4]。有研究表明连续8周向大鼠腹腔注射MC-LR，大鼠肾小球出现病理性变化，如塌陷、基底膜增厚等，肾损伤现象明显[4-6]。同时MC-LR还具有强促癌活性，饮水中的MC-LR被认为是导致原发性肝癌的一个重要因素[7]。MC-LR除了可通过饮水途径摄入体内，还可在水生生物体内富集，从而通过食物链富集到人体内[8-10]。因此，世界卫生组织及我国饮用水标准[11]均规定MC-LR的含量不得超过1 μg·L-1。

MCs影响环境生态的同时也严重威胁着人类健康，越来越受到国内外学者的广泛关注，如何快速检测和高效环保降解MC-LR成为当下的研究热点[12-14]。国内外检测MC-LR的方法主要有生物化学测定法、仪器分析法和免疫分析法以及新兴的传感器分析法[15-17]。早期使用的生物化学测定法主要有蛋白磷酸酶抑制法和细胞毒性法，前者酶活性易受到干扰物质的影响，因此常用作定性检测；后者只能检测出毒理作用相似的毒素总量[15]。仪器分析法是目前运用最广泛的方法，较常用的有高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)、气相色谱和质谱(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)联用等[18]。王刚等[19]采用超高效液相色谱/串联质谱法检测水体中的MC-LR，其检出限最低为0.05 μg·L-1，精确度高、灵敏性强、重现性好，但存在仪器昂贵、操作复杂、技术要求高等问题[2,20]。免疫分析法具有灵敏度高、检测速度快、高通量等优点，但是所用试剂价格昂贵，容易出现假阳性[21]。因此，亟需建立一个快速、灵敏、可视化的现场检测方法[22-24]。

相较于传统的检测方法，适配体传感器检测更加高效、方便和灵敏。适配体是体外筛选得到的一段寡核苷酸片段，可作为一种新型的识别元件与靶标以高亲和力特异性结合，具有稳定、易修饰、易于合成等优点[25-27]。适配体传感器可结合电化学、荧光和比色等传感技术构建出不同类型的传感器[28]。其中，电化学适配体传感器的应用最为广泛，检测效率高，检出限低，但大多数采用金电极，成本高[29-30]。荧光传感器检测MC-LR具有一定的优势，但是操作相对繁琐、荧光染料稳定性不高[31]。

金纳米粒子由于其良好的光学性质和生物相容性,常作为比色法传感器中信号传导的理想材料。与其他检测方法相比，基于适配体和纳米金所构建的比色传感器检测技术较为简单，具有成本低、灵敏度高、检测结果可视化等优点[32]，已被广泛应用于致病菌、农兽药残留、肿瘤标志物等小分子的检测[33-34]。但目前对适配体和靶标分子的结合作用机制还不明确，在一定程度上限制了适配体生物传感器的进一步发展。本研究首先基于已报道的MC-LR原始适配体Apt-1序列，建立MC-LR适配体-纳米金检测体系。其次，通过对Apt-1进行定点突变得到二级结构发生明显改变的Apt-3，分析比较Apt-1和Apt-3对MC-LR的亲和力差异，以期为进一步探究适配体的二级结构和靶分子结合的关系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MC-LR适配体-1(MC-LR Apt-1)共60个碱基，引用自文献[35]，序列为：5′-GGCGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′(上海生工生物合成)，MC-LR适配体-3(MC-LRApt-3)共60个碱基，为本研究设计突变适配体，序列为：5′-GGGGCCAAACAGGACCACCATGACAATTACCCATACCACCTCATTATGCCCCATCTCCGC-3′(上海生工生物合成)，双蒸馏水溶解，4℃冰箱保存；微囊藻毒素-LR由浙江工商大学海洋食品研究院提供，-20℃冰箱冷冻保存；氯化钠、四氯金酸、柠檬酸三钠均为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司；四螨嗪标准品、阿特拉津标准品、草甘膦标准品，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

1.2 主要仪器与设备

MRIEX-5型漩涡振荡器，江苏海门其林贝儿仪器制造有限公司；EVOLUTION 60S 型紫外可见分光光度计，美国Thermo Fisher Scientific公司；

1.3 序列优化

对MC-LR适配体-1(Apt-1)进行定点突变，将5′端开始的第3位胞嘧啶替换成鸟嘌呤，命名为适配体-3(Apt-3)。利用Mfold软件，在盐浓度为1 mol·L-1条件下，拟合分析Apt-1和Apt-3的结构，得到2个结构完全不同的适配体。图1-A为Apt-1的二级结构，图1-B为Apt-3的二级结构，并比较二者吉布斯自由能(ΔG)。

图1 MC-LR适配体-1(A)和MC-LR适配体-3(B)的二级结构Fig.1 Secondary structure of MC-LR Apt-1(A)and MC-LR Apt-3(B)

1.4 纳米金的制备

采用柠檬酸三钠还原法制备纳米金[36]。制备中所需烧杯等器皿置于王酸[HNO3∶HCl=1∶3(v∶v)]中浸泡24 h，用超纯水洗净，烘箱烘干待用。量取100 mL 0.01%(w∶v)的氯金酸于烧杯中，在磁力搅拌条件下加热煮沸，沸腾后立即加入3.5 mL 1%柠檬酸三钠水溶液。待溶液变酒红色后继续加热煮沸15 min，直至溶液呈红色、澄清透明状。加热停止，以500 r·min-1的转速继续搅拌15 min，待冷却至室温后，过0.2 μm 聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)滤膜，于4℃保存。制得的纳米金溶液利用紫外可见分光光度计在400～750 nm波长范围内全扫描。

1.5 纳米金比色法检测MC-LR原理

检测原理如图2，纳米金颗粒表面带有大量磷酸根离子，呈负电。当没有电介质存在时，离子间的静电斥力使得粒子处于稳定状态，分散均一，裸AuNPs溶液呈现酒红色。当加入盐溶液后，Na+离子能够中和AuNPs表面的电子，静电引力使得粒子聚集，溶液由红色变为蓝色，吸收峰右移[26]。当适配体以一定的浓度加入到溶液中时，可凭借范德华静电作用等分子间作用力吸附在AuNPs表面保护AuNPs免受盐诱导，AuNPs溶液依然保持分散、稳定的状态。当在受适配体保护的纳米金溶液中存在靶标分子MC-LR时，适配体会与MC-LR特异性结合形成具有规则三维结构的复合物，此时纳米金颗粒失去保护，在盐诱导下呈聚集态，溶液颜色逐渐变为紫蓝色，在一定范围内颜色变化与MC-LR的浓度具有比例关系[37]。因此通过肉眼观察颜色变化便可初步判断MC-LR的浓度[32]。

图2 纳米金比色法检测MC-LR的原理图Fig.2 The principle of MC-LR detection by nanogold colorimetric method

1.6 条件优化

最适盐浓度的确定。反应体系为200 μL，移取190 μL恢复至室温的纳米金溶液于试管中，分别加入10 μL不同浓度的氯化钠溶液，使得其混合液中盐的终浓度分别为0.00、0.02、0.04、0.045、0.05、0.06、0.08 μmol·L-1，混合均匀，静置反应2 min，观察溶液颜色变化，在400～800 nm波长下进行全扫描，每个浓度设置3组平行。

最佳适配体浓度的确定。孵育体系为120 μL，在含有117.6 μL中的纳米金中加2.4 μL不同浓度的Apt-1溶液，使得Apt-1体系终浓度分别为0.00、0.03、0.05、0.08、0.12、0.15 μmol·L-1，混合均匀，常温下避光孵育24 h。孵育后分别加入2 mol·L-1的NaCl溶液，摇匀静置反应2 min后，观察颜色变化，在400～800 nm波长下进行全扫描，重复3次。

与上述Apt-1孵育体系相同，在117.6 μL的纳米金溶液加入2.4 μL不同浓度的Apt-3溶液，使得Apt-3体系终浓度分别为0.00、0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 μmol·L-1，混匀，常温下避光孵育24 h，孵育后分别加入2 mol·L-1的NaCl溶液，摇匀静置反应2 min，观察溶液颜色变化，于400～800 nm波长下进行全扫描，设置3组平行。

1.7 MC-LR的检测

Apt-1：按照1.6所确定的最优反应条件和体系，加入MC-LR溶液，使MC-LR的体系终浓度分别为0、40、70、100、120、150 ng·mL-1，充分混匀，避光反应15 min后，加入NaCl溶液，静置2 min，观察颜色变化，在400～800 nm波长下进行全扫描，空白组以相同体积的超纯水替代Apt-1，设定3组平行。

Apt-3：同理，按照1.6所确定的最优反应条件和体系，加入MC-LR溶液，使MC-LR的体系终浓度分别为0、10、30、50、70、100、120 ng·mL-1，充分混匀，避光反应15 min后，加入NaCl溶液，静置2 min，观察颜色变化，在400～800 nm波长下进行全扫描，空白组以相同体积的超纯水替代Apt-3，设定3组平行。

1.8 纳米金(AuNPs)比色法的特异性

将Apt-1和Apt-3，以1.6所确定的最优反应条件和体系，分别加入等量的MC-LR溶液、四螨嗪标准品、阿特拉津标准品以及草甘膦标准品，各毒素的反应终浓度为100 ng·mL-1，避光孵育15 min后，加入NaCl溶液，静置2 min，观察颜色变化，在400～800 nm波长下进行全扫描。

2 结果与分析

2.1 AuNPs的特性

AuNPs在510～550 nm的可见光光谱范围内具有单一吸收峰，其溶液颜色也随粒径大小的不同而不同[38]。由图3可知，柠檬酸钠还原法制得的AuNPs溶液在520 nm处有1个特征吸收峰。基于520 nm处的吸光度值和消光系数2.70×108L·mol-1·cm-1，求得AuNPs的浓度为3.50 nmol·L-1。

图3 纳米金的紫外吸收光谱图Fig.3 UV absorption spectrum of the AuNPs

2.2 最适盐浓度

由图4-A可知，随着体系盐浓度的增大，520 nm处的吸收峰逐渐下降，发生红移。由图4-B可知，当体系的盐浓度低于0.04 mol·L-1时，溶液保持红色不变；0.045 mol·L-1时颜色发生变化，由红色开始转紫色；且当盐浓度为0.05 mol·L-1时，溶液为蓝色，浓度继续增大，蓝色加深不明显，吸收峰变化差异不大，表明体系中的AuNPs已经完全聚集。由于盐浓度过高会干扰体系的检测，使其灵敏度下降，因此选择最适盐浓度为0.05 mol·L-1。该结果与陈思锐等[39]对体系中盐浓度优化的结果相同。

注：氯化钠浓度：1：0.00 mol·L-1；2：0.02 mol·L-1；3：0.04 mol·L-1；4：0.045 mol·L-1；5：0.05 mol·L-1；6：0.06 mol·L-1；7：0.08 mol·L-1。Note：Sodium chloride concentration.1:0.00 mol·L-1.2:0.02 mol·L-1.3:0.04 mol·L-1.4:0.045 mol·L-1.5:0.05 mol·L-1.6:0.06 mol·L-1.7:0.08 mol·L-1.图4 不同氯化钠浓度下AuNPs溶液的紫外-可见吸收光谱(A)和颜色变化(B)Fig.4 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Sodium Chloride concentrations

2.3 适配体浓度的优化

图5-A为不同浓度Apt-1孵育下的AuNPs溶液加盐后在400～800 nm范围的吸收光谱图。当加入一定浓度盐溶液后，裸AuNPs溶液变蓝色(图5-B)，且520 nm处的吸收峰下降，在700 nm左右开始出现新的吸收峰，说明此时金纳米颗粒已发生聚集。随着适配体浓度的升高，吸附在纳米金表面的分子越多，对纳米金颗粒的保护作用越强，表现在520 nm处的峰值逐渐增高，700 nm左右的峰值逐渐降低。当浓度为0.03 μmol·L-1和0.05 μmol·L-1时，保护作用初显，表现为淡紫色和紫红色；当适配体浓度为0.08 μmol·L-1时，颜色变为红色，说明适配体对AuNPs的保护充分；适配体浓度继续加大，颜色变化不明显，520 nm处的吸收峰差别不大，考虑到检测的灵敏度，选择0.08 μmol·L-1作为Apt-1的最佳孵育浓度。

注：适配体-1浓度：1:0.00 μmol·L-1；2:0.03 μmol·L-1；3:0.05 μmol·L-1；4:0.08 μmol·L-1；5:0.12 μmol·L-1；6:0.15 μmol·L-1。Note:Apt-1 concentration:1:0.00 μmol·L-1.2:0.03 μmol·L-1.3:0.05 μmol·L-1.4:0.08 μmol·L-1.5:0.12 μmol·L-1.6:0.15 μmol·L-1.图5 不同Apt-1浓度下AuNPs溶液的紫外可见吸收光谱(A)和颜色变化(B)Fig.5 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Apt-1 concentrations

Apt-3的结构与Apt-1完全不同，与纳米金的结合能力也有所差异。由图6-A可知，随着Apt-3的浓度增大，520 nm处的吸收峰逐渐升高；颜色如图6-B所示，当Apt-3浓度为0.00 μmol·L-1时，纳米金受盐诱导发生聚集，变为蓝色。当加入0.03 μmol·L-1的Apt-3溶液时，部分纳米金发生聚集，颜色为紫色；孵育Apt-3体系浓度达到0.06 μmol·L-1时，溶液呈现为红色，对AuNPs的保护作用显著，Apt-3浓度升高，溶液颜色保持为红色，其稳定性也不会随着浓度的增大而变化[36]。确定最终的Apt-3孵育浓度为0.06 μmol·L-1。

注：适配体-3浓度：1:0.00 μmol·L-1；2:0.03 μmol·L-1；3:0.06 μmol·L-1；4:0.09 μmol·L-1；5:0.12 μmol·L-1；6:0.15 μmol·L-1。Note:Apt-3 concentration:1:0.00 μmol·L-1.2:0.03 μmol·L-1.3:0.06 μmol·L-1.4:0.09 μmol·L-1.5:0.12 μmol·L-1.6:0.15 μmol·L-1.图6 不同Apt-3浓度下AuNPs溶液的紫外-可见吸收光谱(A)和颜色变化(B)Fig.6 UV-vis absorption spectra (A)and visual color changes (B)of the AuNPs solutions with different Apt-3 concentrations

2.4 Apt-AuNPs比色法检测MC-LR

由图7可知，裸AuNPs在加入盐溶液后发生聚集，变成灰蓝色。随着MC-LR的浓度升高，适配体优先与MC-LR特异性结合形成特殊构象，AuNPs逐渐失去外层的保护作用，在高盐浓度下，越来越多的AuNPs发生聚集变色，蓝色加深。当体系的MC-LR浓度为0 ng·mL-1时，反应液为紫红色，当体系的MC-LR浓度达到70 ng·mL-1时，反应液呈现灰紫色，并且随着MC-LR浓度的升高颜色逐渐加深(图7-A)。当体系中MC-LR达到30 ng·mL-1时，反应液呈现灰紫色，随着MC-LR浓度的增大，颜色加深为灰蓝色(图7-B)。

注：微囊藻毒素-LR浓度：A1：裸纳米金；A2：0 ng·mL-1(未加盐)；A3：0 ng·mL-1；A4：40 ng·mL-1；A5：70 ng·mL-1；A6：100 ng·mL-1；A7：120 ng·mL-1；A8：150 ng·mL-1。B1：裸纳米金；B2：0 ng·mL-1(未加盐)；B3：0 ng·mL-1；B4：10 ng·mL-1；B5：30 ng·mL-1；B6：50 ng·mL-1；B7：70 ng·mL-1；B8：100 ng·mL-1；B9:120 ng·mL-1。Note：MC-LR concentration.A1:Pure AuNPs.A2:0 ng·mL-1(no Sodium Chloride).A3:0 ng·mL-1.A4:40 ng·mL-1.A5:70 ng·mL-1.A6:100 ng·mL-1.A7:120 ng·mL-1.A8:150 ng·mL-1.B1:pure AuNPs.B2:0 ng·mL-1(no sodium chloride).B3:0 ng·mL-1.B4:10 ng·mL-1.B5:30 ng·mL-1.B6:50 ng·mL-1.B7:70 ng·mL-1.B8:100 ng·mL-1.B9:120 ng·mL-1.图7 对不同浓度微囊藻毒素-LR检测下(Apt-1)-AuNPs(A)和(Apt-3)-AuNPs(B)反应液颜色变化Fig.7 Visual color changes of the (Apt-1)-AuNPs(A)and (Apt-3)-AuNPs(B)solutions for detection of MC-LR with different concentrations

2.5 纳米金定量检测MC-LR

由图8可知，随着MC-LR的浓度加大，520 nm的吸收峰逐渐降低，最大吸收峰由520 nm右移至700 nm左右处。由图9可知，当MC-LR浓度范围为0～120 ng·mL-1时，(Apt-3)-AuNPs体系检测MC-LR的A673/A520比值与MC-LR的浓度呈线性关系，其线性回归方程为y=0.007x+0.564(R2=0.988 5)，线性关系良好，根据LOD=3×SD/K(SD为空白标准偏差，K为标准曲线斜率)，求得其理论最低检测限为7.08 ng·mL-1。

图8 不同浓度的微囊藻毒素-LR溶液下(Apt-3)-AuNPs溶液的紫外-可见吸收光谱Fig.8 UV-vis absorption spectra of the (Apt-3)-AuNPs solution with different MC-LR concentrations

图9 微囊藻毒素-LR浓度与 (Apt-3)-AuNPs溶液A673/A520的关系Fig.9 Correlation between MC-LR concentration and A673/A520of (Apt-3)-AuNPs solution

2.6 AuNPs比色法检测MC-LR的特异性

为了分析基于Apt-1和Apt-3所建立的AuNPs比色法的特异性，选取了3种可能与MC-LR共存于污染水体的干扰物质：四螨嗪、阿特拉津以及草甘膦。由图10-A、B可知，在最优反应条件下，当MC-LR和其他干扰物均为100 ng·mL-1时，(Apt-1)-AuNPs和(Apt-3)-AuNPs两个检测体系仅在MC-LR存在时出现明显的凝集反应，吸收峰发生明显的红移。而四螨嗪、阿特拉津以及草甘膦由于无法使适配体从AuNPs上脱离，加入盐溶液后仍然表现为红色，并且反应混合液在520 nm处出现了特征峰，说明基于Apt-1和Apt-3所建立的AuNPs检测方法特异性良好。

注：A,C：Apt-3;B,D：Apt-1；1-6：Apt-AuNPs solution、裸AuNPs、MC-LR、四螨嗪、阿特拉津、草甘膦。Note:A，C:Apt-3.B,D:Apt-1.1-6:Apt-AuNPs solution,pure AuNPs,MC-LR,clofentezine,atrazine,glyphosate.图10 AuNPs比色法的特异性评价Fig.10 Evaluation of the specificity of the AuNPs assay

3 讨论

随着筛选技术的成熟，越来越多的靶标分子的核酸适配体被筛选出来，并应用到快速检测、传感器开发、靶向药物研究等方面[34]。在筛选得到原始适配体后，一般都要求对其进行截短、修饰或者碱基突变等序列优化以满足不同领域的需要[40-41]。核酸适配体对靶标的特异性识别是基于其自身多样性的二级结构诸如发夹、假结、茎、环、G-四聚体等，在遇到靶标时会发生自适应性的构象变化，形成特殊的三维结构，通过范德华力和氢键等作用达到力的平衡，形成稳定的复合物[41-42]。陈思锐等[39]通过对Apt-1两端分别依次剪裁2个碱基得到新适配体序列56MC-LR、52MC-LR、48MC-LR等，发现除了56MC-LR，其他截短的适配体活均性有所下降，推测这可能与Apt-1的5′始端唯一的环部结构被破坏有关。

由于富含G的序列更容易形成分子间或分子内G-四聚体等稳定构象[42]，因此将5′端第3个碱基C突变为G，突变后得到的Apt-3的二级结构发生了明显改变。将Apt-1和Apt-3分别与纳米金溶液孵育后，(Apt-1)-AuNPs体系在MC-LR浓度为70 ng·mL-1时可观测到颜色变化，而经突变后的(Apt-3)-AuNPs体系在MC-LR浓度为30 ng·mL-1即可表现出明显的颜色差异。这说明Apt-1、Apt-3与MC-LR具有良好的亲和力，而Apt-3表现出更强的亲和力。

结果表明，将第3位碱基C突变为G并没有影响适配体与靶标分子的有效结合，推测该位点并不是适配体与MC-LR作用的结合位点[34]。由于适配体结构变化可使其与靶标结合的空间距离发生改变，从而影响对靶标的亲和力。有研究认为适配体环状部位为其主要的结合区域，由茎部结构作为“双臂”支撑来保持其稳定性[43]。据此推测Apt-3亲和力增加可能是由于其形成了更复杂的茎环结构，吉布斯自由能更小，稳定性增加以及其与靶标分子的空间距离改变。

(Apt-3)-AuNPs对MC-LR的理论最低检测限为7.08 ng·mL-1，线性检测范围为0～120 ng·L-1，说明检测效果良好。Hu等[44]研究了检测MCs的SPR免疫传感器，线性范围达到1～100 μg·L-1，Chen等[45]构建的SPR免疫传感器检测MC-LR，检出限为0.55 ng·mL-1，但是SPR免疫传感器的制作成本高，难以推广使用。本试验所用的适配体和纳米金成本低，操作简便，灵敏度较高，优化序列后获得比Apt-1亲和力更高的Apt-3，能在一定程度上满足可视化的现场检测需求。

适配体非必需碱基的存在可影响其与靶标的结合[40]，接下来还需要对Apt-3进行裁剪优化，以探究与靶标MC-LR的核心结合区域，获得亲和性更高的适配体，通过进一步优化反应时间、体系pH值、修饰适配体等途径提高检测体系的灵敏度，实现实时、快速、简便、可视化的现场检测。

4 结论

本研究通过定点突变获得Apt-3，在(Apt-3)-AuNPs孵育体系中加入靶标MC-LR，AuNPs在高盐浓度下可发生不同程度的聚集，出现颜色变化。发现突变后的Apt-3依然保持高特异性，与Apt-1相比，Apt-3与MC-LR的亲和力更高，推测该突变位点不是靶标的活性作用位点，突变后的Apt-3拥有更复杂的茎环结构，有利于与小分子MC-LR的结合。建立的(Apt-3)-AuNPs体系实现了对MC-LR的定量、快速、简便灵敏的检测。本研究结果为后续探究靶标分子识别与结合机制，开发更高灵敏度的传感器提供了依据。