60Co-γ射线对莲子的辐射效应及狭瓣变异株的形态分析

刘凤栾 秦 密 宇 胜 刘青青 张大生 田代科,*

(1 上海辰山植物园中国科学院上海辰山植物科学研究中心,上海 201602；2 上海市资源植物功能基因组学重点实验室,上海 201602；3 合肥植物园,安徽 合肥 230031)

现代作物良种选育技术中，物理射线辐射育种是重要的辅助手段之一。截至2020年10月，在联合国粮农组织/国际原子能机构(FAO/IAEA，https://mvd.iaea.org/#!Search)登记的3 362个突变选育品种中，2 610个为物理射线诱变所得，其中1 808个使用了60Co-γ射线，占69.3%，表明60Co-γ射线已成为目前作物辐射育种的主要处理方法[1-3]。近20年，国内外利用60Co-γ 辐射培育观赏植物良种时，种子因易得量大、操作方便，是主要的使用材料之一[4-5]，其辐射效应包括半致死剂量[6-8]、种子萌发效果[9-11]、幼苗生长与形态变异[12-14]、植株生理生化[4,15-18]及抗性变化[3-4,19-20]、性状改良[21-22]、染色体结构[23]及分子水平的遗传变异[24-25]等，已均有报道，部分研究获得了良好效果[26-27]。

荷花(NelumboAdans.)辐射育种的详细报道始于2000年，我国育种者利用60Co-γ辐射30个荷花品种的杂交种子，发现引起变异的剂量范围在0.5～1.5万伦琴[28]。以泰国品种Sattabut组培苗为材料，γ射线辐射处理可使其新生叶柄发生玻璃化以及叶片出现轮列型气孔[29]。随后莲藕也开始被用作辐射处理对象[30-31]。例如，美洲莲(N.luteaWilld.)莲藕经γ射线辐射处理，诱导出开花光照期缩短1 h的突变株[32]。近期，泰国育种者也在尝试使用γ射线处理种藕和莲子以选育荷花新奇品种[33-34]，国内则开始摸索野生型莲子的60Co-γ辐射效应[35]。但由于辐射源、辐射操作和栽培方式等方面的差异，上述报道种藕或莲子之间的辐射效应差异较大，尤其无法确定60Co-γ对荷花野生型和现代优良品种莲子的半致死剂量差异。我国作为荷花的分布与栽培中心之一，保有大量的野生型种质资源，培育品种达2 888个，占全球64.3%[36]。因此，明确荷花野生型和栽培品种莲子对各种物理和化学诱变的响应差异，以指导荷花的实践育种，是充分利用我国荷花种质资源、创制新种质的途径之一。

本研究以野生型微山红以及50个栽培品种的莲子为材料，通过60Co-γ辐射剂量先大跨度后小范围的方式，筛选并确定两类莲子的半致死剂量，并对所得狭瓣变异单株进行形态分析，旨在为γ射线诱导野生型和品种莲子变异、选育荷花新种质提供技术参考，为研究荷花的花被片发育和人工射线作用机制提供优良材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究使用亚洲莲的野生型和栽培品种两类莲子：野生型微山红(N.nuciferaWeishan Hong)莲子采自山东省微山湖的核心湖区(116°49′23″E，35°2′59″N)自然结实果实。栽培品种莲子采自上海辰山植物园国际荷花资源圃(2016年国际睡莲水景园艺协会International Waterlily &Water Gardening Society认证)自然结实的果实，共选择粉团、巨子、单洒锦等50个品种，涉及白、粉、粉红、红、复色和洒锦共6种花色的单瓣和重瓣品种，以最大程度反映栽培品种的整体特性。

1.2 辐射处理步骤与方法

首先以微山红莲子为材料进行60Co-γ半致死剂量(semi-lethal dose,LD50)初筛：2016年春季，在中国科学院合肥物质科学研究院，使用人工60Co-γ射线辐射处理。设置20、40、80、160、320、500、750、1 000 Gy共8个剂量梯度，分别处理50、50、50、100、100、100、200和200粒微山红莲子，另选50粒作为对照组，不做辐射处理。将辐射处理后的莲子破壳、浸水催芽。在催芽14和21 d时，统计各辐射处理梯度下的萌芽率，然后定植于盆内(直径45 cm)，栽培管理期间多次观察记录、拍照，当年秋季调查存活率，试验于上海市松江区新浜镇荷花基地完成。2017年春季，根据上年存活率，缩小剂量范围为150、160、170、180、200 Gy，以判定莲子60Co-γ的LD50：每个梯度50粒微山红莲子和100粒栽培品种莲子(50个品种，每个品种2粒，为辐射操作方便进行混合)，两者的对照分别为20和100粒。催芽后定植缸内(直径50 cm)，调查萌芽率、存活率以及形态变化。试验分别在上海辰山植物园和安徽省合肥植物园完成。萌芽率=绿色子叶伸出莲壳的长度大于或等于莲子自身长度状态的莲子数/被处理莲子数×100%；存活率=实生苗生长至当年立秋之后的植株数量/被处理莲子萌芽数量(全部移栽)×100%。

1.3 半致死剂量的计算

使用SPSS 22.0软件，以第二次辐射剂量0(CK)、150、160、170、180、200 Gy及其对应存活率为基础，拟合一元线性回归方程Y=bX+a，并利用“回归-线性”参数求算决定系数(R2)，以检验方程的拟合优度。其中，Y为植株存活率，X为辐射剂量；Y=50%时的X值即为半致死剂量(LD50)，Y=40%的X值为临界剂量(LD40)。

1.4 变异植株主要性状的测量

形态指标以花朵和叶片表型为主。花朵性状于花开第2天上午花朵完全打开时测量为准，其中花被片长度为基部至顶端的距离，宽度为花被片最宽处距离，因花被片最外侧第1～第6枚开花时易失水变形，为减小测量误差，自第7～第8枚花被片开始测量。花被片数和雄蕊数：为防止外层花被(萼片状)过早脱落，将出水后的花蕾套入网兜内，开花前1～2 d采收统计。自交结实率：人工自花授粉结实后成熟花托内饱满果实数与其心皮(胚珠)数之比。利用SPSS 22.0软件分析数据差异显著性。

2 结果与分析

2.1 60Co-γ辐射微山红莲子的半致死剂量范围初筛

催芽14 d时调查发现，500 Gy及更低剂量的莲子萌芽率与对照组无差异，750和1 000 Gy剂量对应的萌芽率小于对照(表1)。就钱叶生长势而言，20 Gy处理的莲子萌发钱叶数量与对照相似，40 Gy处理较对照生长旺盛，自80 Gy剂量起，莲子的钱叶数量随辐射剂量增加开始减少，至320 Gy剂量时差异明显，750和1 000 Gy剂量处理组无展开钱叶(图1)。同时，各剂量下莲子的根系生长也表现出差异，80 Gy及更高剂量处理的莲子根系长度及数量明显小于对照(图1)。

图1 8个辐射剂量下微山红莲子的萌芽、差异(催芽14 d)Fig.1 Differences in germination of Weishan Hong seeds treated by eight doses of 60Co-γ when cultured in water for 14 days

在浸水催芽20 d时，750和1 000 Gy辐射莲子分别出现3片和2片钱叶，且展开不完全。此时，将所有萌发莲子定植于直径45 cm塑料盆内，每2周观察1次生长情况。夏季7—8月份，多数存活的植株生长正常，部分表现出浮叶偏多、立叶偏少或叶柄直立性降低的现象(图2-A)；常有叶片以叶脐为中心出现梭形痕迹且凹凸不平(图2-B)，个别叶片的叶脐呈现粉红色变化(图2-C)。

立秋之后统计所有实生苗的存活状况，发现20、40和80 Gy辐射剂量下的实生苗均100%存活，160 Gy剂量下存活率为67.0%，至320 Gy剂量时下降为38.9%，而1 000 Gy剂量下无植株存活(表1)。对野生型微山红的莲子而言，其60Co-γ的LD50在160～320 Gy之间。

表1 大辐射剂量跨度下微山红莲子的萌芽率和存活率变化Table 1 The germination rate and survival rate of Weishan Hong seedlings under a large span of irradiation doses

2.2 野生型和栽培品种莲子半致死辐射剂量的确定

注:A:实生苗叶柄直立性降低;B:部分叶片呈现轻微褶皱;C:少量叶脐出现粉红色。Note:A:The orthotropism of seedling petiole reduced.B:Slightly wrinkled leaves.C:Some of leaf navels displayed pink.图2 辐射微山红实生苗生长过程中的主要形态变化Fig.2 Main morphological changes during the growth of irradiated Weishan Hong seedlings

2017年4月在150～200 Gy的小剂量范围内，分别辐射微山红和50个栽培品种混合莲子，以获得较为精确的荷花野生型和栽培品种的两种类型莲子在60Co-γ射线下的LD50。基于6个辐射梯度及其存活率(表2)，获得微山红为野生型荷花代表的线性回归方程y=-0.260 7x+100.1(R2=0.983 8>0.8)，为极显著相关，LD50为192 Gy；现代优良栽培品种的线性回归方程y=-0.285 2x+99.2(R2=0.984 1>0.8)，LD50为173 Gy，即栽培品种的莲子对60Co-γ射线的耐受性略低于野生型的微山红莲。然而，在幼苗和成苗的形态上，两者无显著差异，均有类似大范围剂量筛选时的叶柄扭曲、卷叶褶皱痕迹明显等现象(图2)。

表2 60Co-γ辐射对野生型和品种莲子发育的影响Table 2 Effects of 60Co-γ irradiation on germination and seedling development of wild type and cultivars of lotus

2.3 辐射变异单株微山红M652及其主要形态变化

莲子经过辐射处理后，当年开花率降低，320 Gy及其以上高辐射剂量处理组表现更为显著，即60Co-γ辐射处理干扰了荷花藕芽或花芽的分化和(或)发育能力。2017年夏季，在2016年80 Gy辐射剂量下存活的微山红植株中，发现一株花被片变为狭长形的特异单株(图3)。经2018—2019年连续莲藕分株栽培观测，花被片形态特征一致且稳定，因此作为一个新品种命名为辰山飞燕，并完成莲属国际登录。

与野生型微山红相比(图3-A、B、C)，变异辰山飞燕的主要形态特征为花蕾狭长和花被片狭长(图3-D、E、F)。花开2 d时，辰山飞燕的花被片宽长比均值为0.31，显著小于野生型，但是两者花被片的宽度和长度均值均无显著差异(表3)。同时，辰山飞燕每朵花平均花被片数只有19.7(变化范围18～22)，显著低于野生型微山红的23.2(变化范围22～25)，其开花数量和立叶数量也显著低于微山红，并且无法自交结实(表3)。

虽然辰山飞燕的花被片更加狭长，但与野生型微山红植株相比，其花开2 d时花朵的直径×高度均值并未显著增大，而其变幅在群体内花朵之间增大(表3)，这源自辰山飞燕开花形态既有与野生型微山红一致的碗状，也常现收拢成杯状和平展碟状(图3-F)，即其花态变化更加丰富。除花瓣形状变化较大外，辰山飞燕的叶片也常现紧密包裹状或狭长鱼鳍状等畸形发育(图3-G、H、I)，这种变化特征是荷花品种中极为少见的观赏性状之一。

表3 狭长瓣辰山飞燕和野生型微山红主要表型差异Table 3 Major phenotypic differences between narrow-tepalled Chenshan Feiyan and wild-type Weishan Hong

注:A、B、C:野生型微山红花蕾、花开1 d和2 d;D、E、F:辰山飞燕花蕾、花开1 d和2 d;G、H、I:辰山飞燕偶尔出现的畸形发育荷叶。Note:A,B,C:Bud,1 and 2 d flowers of wild Weishan Hong.D,E,F:Bud,1 and 2 d flowers of variant Chenshan Feiyan.G,H,I:Malformed leaves of Chenshan Feiyan.图3 辐射所得变异辰山飞燕与其野生型的花朵和叶片形态差异Fig.3 Morphological differences in flowers and leaves of Chenshan Feiyan compared to its wild type

3 讨论

3.1 莲子的60Co-γ辐射剂量选择

植物种子结构与成分各不相同，使得60Co-γ射线的穿透效果不一。近20年，使用γ射线处理观赏植物种子的报道中，多数的剂量范围为0～500 Gy[4,16]。莲子作为荷花的果实，本质是一种坚果，其果壳不仅厚实坚硬且物化性质独特[37-38]。因此，本研究在初始辐射处理时设置了超过常规剂量范围的750和1 000 Gy，以较为全面地检测60Co-γ射线对莲子的辐射效应：在这2个高剂量处理下，莲子催芽后叶柄可正常生长且有极少量钱叶展开，暗示相比其他多数植物的种子[4]，莲子对60Co-γ射线的耐受性较高。

3.2 野生型和栽培品种莲子对60Co-γ耐受性(半致死剂量)差异

LD50是衡量植物材料对物理射线耐受性的指标之一，在实践中常被选做适宜的辐射处理剂量。然而，由于植物材料本身(例如种子的物化性质、成熟度等)、辐射源本身(半衰期)以及操作方式(辐射源距离、材料摆放方式)等方面的差异，致使同一种植物材料在不同辐射处理条件下表现出不同的辐射效果。在早期的莲子辐射试验中，检测到20个荷花品种莲子对60Co-γ射线的LD50为50 Gy左右，并建议其适宜诱变剂量为30～60 Gy[30]；近期对野生型荷花资源微山红和黑龙江红辐射处理时发现，其莲子的LD50分别为125和160 Gy[35]，泰国本土品种Pathum莲子的LD50可达28 Krad(280 Gy)[34]。由此可见，荷花野生型和栽培品种两类莲子对60Co-γ射线的耐受性存在差异，但此差异的相对量尚未明确。在相同辐射处理与栽培条件下，本研究确定了野生型荷花微山红和50个现代品种莲子的LD50分别为192和173 Gy，即两者对60Co-γ射线的耐受性相差19 Gy。若将60Co-γ射线可能对莲子胚因辐射直接致死而未萌芽的因素考虑在内，计算出微山红与栽培品种的LD50分别为198和162 Gy。因此，基于莲子和辐射源本身的差异，结合临界剂量(LD40)，建议今后使用野生型(以及遗传背景相对单一的地方传统品种)和20世纪以来选育的现代品种的莲子进行辐射育种或诱变突变体时，辐射剂量可分别在150～200 Gy和130～180 Gy范围内选择。然而，目前同一条件下使用60Co-γ辐射处理野生莲和品种莲子开展比较分析尚无其他报道，因此，上述推荐辐射剂量范围的参考价值有待进一步重复试验从而进行验证与评价。

3.3 60Co-γ射线对荷花生长与形态的主要影响

在荷花7个物理射线育种报道中，无论研究对象为组培苗、种藕或莲子，其幼苗及植株对γ射线响应最突出的均为叶柄和叶片的异常或畸形发育，而花朵各部分变异较少或不显著[31,34-35]。推测其主要原因：一是幼苗生长过程中，其强大的自我修复能力使得辐射损伤逐渐削弱，使得后续新生芽点发育逐步恢复正常[39]；其二，在观赏植物中，利用60Co-γ辐射选育新奇品种，目前总体效果较好但比例低，即被处理植物材料需要在数量上得到一定保证，才有机会获得目标性状。本研究中辐射莲子的幼苗多数表现出叶柄瘦弱、弯曲或扭曲以及成活植株的立叶少等现象，但在后续2年的生长周期中，此现象逐渐减少；在辐射的1 650粒(微山红900粒+250粒，栽培品种500粒)莲子中，仅获得1个变异株，培育成性状稳定的新品种辰山飞燕，此结果再次辅证了以上推测。

4 结论

野生型微山红和栽培品种的莲子对60Co-γ射线的耐受性存在一定差异，两者的LD50分别为192和173 Gy，建议今后辐射育种时处理野生莲和栽培品种莲子的剂量分别选择150～200 Gy和130～180 Gy。由狭长花被片变异株育成的辰山飞燕，为今后培育类似菊瓣等极端瓣形的荷花新奇品种和研究植物花被片形状的遗传发育机制提供了良好的材料。