超高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、甲硝唑

于浩洋，祁珍祯，朱冰雅，李颜岩

(辽宁省疾病预防控制中心，沈阳 110005)

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素属于氯霉素类抗生素，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有很强的活性，能抑制细菌蛋白质的形成，表现出广谱抗菌能力，因其良好的抗菌性能，曾被广泛应用到畜牧业及水产养殖中［1］。当人们食用了使用氯霉素类抗生素的畜牧业或水产品后，氯霉素类抗生素会残留于人体内。随着氯霉素类抗生素的大量使用，其不良作用也逐渐表露出来，可导致粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、灰婴综合征等，严重威胁人类健康［2-3］。当前，世界上许多国家已禁止氯霉素类药用于动物食品的生产，并规定了其在畜产品中最高残留限量，美国、欧盟规定氯霉素残留限量标准为“零容许量”，即不得检出［4］。甲砜霉素和氟甲砜霉素抗菌谱与氯霉素相似，较氯霉素毒性有所降低，被广泛用于养殖业，为保障食品安全，我国、欧盟等均制定了其在动物源性食品中的最大残留限量［5-7］。

甲硝唑(MTZ)属于硝基咪唑类抗生素，被普遍用于预防和控制蜜蜂孢子虫病，对厌氧细菌十分有效［8］。硝基咪唑类药物对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用和遗传毒性，通过食品接触可能对人类健康构成潜在威胁［9-10］。欧盟EEC 2377／90 标准中，甲硝唑被列为禁止添加药物［11］。我国农业部最新颁布的第250 号公告《食品安全国家标准食品中兽药最大残留量》［12］中规定动源性食品中不得检出氯霉素、甲硝唑，动物源性食品中甲砜氯霉素的最高残留限量为50 μg／kg，氟甲砜霉素最高残留限量（以氟苯尼考与氟苯尼考胺之和计）为100～3 000 μg／kg。

尽管国家已颁布了食品中抗生素残留标准的相关政策，仍有部分蜂农罔顾法纪，受利益驱使违规使用抗生素，近几年偶有检出阳性蜂产品［13-14］，给消费者的身体健康带来危害，因此加强对蜂蜜中抗生素使用的把控与监管，保障蜂蜜的食品安全非常必要。蜂蜜中甲硝唑或氯霉素类化合物的检测方法很多［15-16］，主要有高效液相色谱(HPLC)法［17］、气相色谱－质谱(GC－MS)法［18］、液相色谱-质谱联用(LC－MS／MS)法［19-20］。由于甲硝唑与氯霉素类化合物的化学结构有较大差异，在溶剂中，氯霉素类化合物带负电荷，甲硝唑带正电荷，因此在使用液相色谱-串联质谱法检测时，需要分别采用正离子和负离子扫描模式进行采集，较为繁琐。目前，同时测定甲硝唑和氯霉素类化合物的方法报道较少，张琳等［21］使用液相色谱-质谱联用法同时检测动物源性食品中氯霉素和甲硝唑，但蜂蜜是一个高糖分、有机酸复杂的样品，检测的干扰性比较大，其没有使用内标或固相萃取柱净化以消除基质干扰。笔者采用超高效液相色谱-串联质谱法以氯霉素-D5和甲硝唑-D4为内标同时测定蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素的残留，采用固相萃取柱净化以达到消除基质干扰的目的，操作简便快捷，定性定量准确，检出限低，灵敏度高，重现性好，能满足同时检测蜂蜜中甲硝唑和氯霉素类化合物的需要。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：3200QTRAP型，美国AB 公司。

涡旋振荡器：Lab Dancer 型，德国艾卡公司。

高速冷冻离心机：Thermo ST16R 型，美国赛默飞世尔公司。

电子天平：BS 110S 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

超纯水系统：MILLI-Q Gradient 型，法国默克密理博公司。

高速离心机：TGL-16A 型，上海安亭科学仪器厂。

氮吹仪：urboVap LV 型，美国Caliper Life Science 公司。

固相萃取仪：Vac Elut SPS 24 型，美国安捷伦科技有限公司。

超声波清洗器：KQ5200DB 型，昆山市超声仪器有限公司。

Pall Corpration Acrodisc 针式滤器：孔径为0.2 μm，直径为13 mm，美国颇尔公司。

固相萃取柱：Oasis MCX 型，柱容积为6 mL,填料质量为150 mg，美国沃特世公司。

氯霉素-D5：编号为H409107AL，质量浓度为100 ng／μL，德国Dr. Ehrenstorfer 公司。

氯霉素、甲硝唑-D4、甲硝唑、氟甲砜霉素、甲砜霉素标准物质：编号分别为G974527、G174488、G133045、G169577、G988144，质量分数分别为99.8%、98.5%、96.2%、99.9%、99.3%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯：色谱纯，美国费希尔公司。

甲酸：色谱纯，美国福禄克公司。

乙酸铵：色谱纯，德国CNW 公司。

氨水：分析纯，西陇科学股份有限公司。

盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Kinetex C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，美国沃特世公司）；柱温：40 ℃；样品室温度：4 ℃；流动相：A 相为乙腈，B 相为5 mmol／L 乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）；流量：0.4 mL／min；进样体积：10 μL；梯度洗脱条件见表1。

表1 色谱分离梯度洗脱条件

1.2.2 串联质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；离子喷雾电压：5 500 V（正离子）～4 500 V（负离子）；离子源温度：550 ℃；喷雾气压力：413.7 kPa；辅助加热器压力：413.7 kPa；气帘气压力：137.9 kPa；扫描方式：甲硝唑、甲硝唑-D4为正离子扫描模式，氯霉素、氯霉素-D5、氟甲砜霉素、甲砜霉素为负离子扫描模式。4 种抗生素及内标质谱参数及保留时间见表2 所示。

表2 4 种抗生素及内标的质谱参数及保留时间

1.3 实验步骤

1.3.1 样品预处理

准确称取5 g 蜂蜜（精确至0.01 g）置于50 mL离心管中，向其中加入100 μL 20 ng／mL 的氯霉素-D5应用液、100 μL 20 ng／mL 的甲硝唑-D4应用液，加入10 mL 水，混匀溶解，再加入10 mL 乙酸乙酯，涡旋提取3 min，以10 000 r／min 离心3 min，吸取乙酸乙酯相5 mL 于10 mL 试管中，40 ℃水浴氮气吹干后，先加入0.1 mL 甲醇溶解，再加入1.9 mL 40 mmol／L 盐酸溶液，涡旋30 s，转入2 mL 离心管，15 000 r／min 离心3 min，上清液待净化。

先后用6 mL 甲醇、6 mL 水、6 mL 40 mmol／L的盐酸溶液活化平衡MCX 固相萃取柱，然后将上述上清液转移至MCX 柱内，待样品过柱后，用6 mL 水淋洗除杂，真空抽干柱内液体后加入5 mL 乙酸乙酯洗脱，收集于氮吹管内，得到洗脱液1；再用6 mL 甲醇淋洗除杂，真空抽干后用5 mL 5%氨化甲醇洗脱，收集于氮吹管内，得到洗脱液2；洗脱液1 和2 在40 ℃水浴下氮气吹干，先向其中加入0.1 mL 甲醇溶解残留物，再加入0.9 mL 10%甲醇-水溶液混匀，过0.22 μm 滤膜后上机分析。洗脱液1 用于分析氯霉素类抗生素，洗脱液2 用于分析甲硝唑。

1.3.2 溶液的配制

氯霉素、氟甲砜霉素、甲砜霉素、甲硝唑单一标准储备液：分别准确称取4 种抗生素标准物质各0.010 g(精确到0.000 01 g)，以甲醇溶解并定容至10 mL，得到4 种抗生素质量浓度均为1.0 mg／mL的单一标准储备液，于-20 ℃避光保存。

混合标准储备液：准确移取4 种抗生素单一标准储备液500 μL 于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至标线，得到4 种抗生素质量浓度均为10.0 μg／mL 的混合标准储备液，于-20 ℃下保存。

混合标准应用液：准确移取混合标准储备液25 μL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至标线，得到4种抗生素质量浓度均为25.0 ng／mL 的混合标准应用液，于4 ℃下保存。

氯霉素-D5应用液：准确移取50 μL 质量浓度为100 μg／mL 的氯霉素-D5标准物质于50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至标线，得到质量浓度为100.0 ng／mL 的氯霉素-D5储备液，于-20 ℃保存；后用甲醇稀释至20.0 ng／mL ，于4 ℃保存。

甲硝唑-D4应用液：准确称取0.010 g（精确到0.000 01 g）甲硝唑-D4标准物质，用甲醇溶解并定容至100 mL，质量浓度为0.1 mg／mL ，于-20 ℃保存；后用甲醇稀释至20.0 ng／mL，于4 ℃保存。

系列混合标准工作溶液：分别吸取25.0 ng／mL抗生素混合标准应用液0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mL，20.0 ng／mL 氯霉素-D5和甲硝唑-D4应用液各100 μL，25%乙腈-水溶液，定容至1.0 mL，制备成4 种抗生素的质量浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng／mL 的系列混合标准工作溶液。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

在电喷雾正负离子模式下对质谱条件进行优化，发现氯霉素、氯霉素-D5、甲砜霉素、氟甲砜霉素均能在负离子条件下电离，Q1 扫描时出现丰度较高的［M-H］-峰，而甲硝唑和甲硝唑-D4可在正离子条件下电离，Q1 扫描时出现丰度较高的［M+H］+峰。分别选择［M-H］-峰作为氯霉素类的母离子、［M+H］+峰作为甲硝唑的母离子，对其进行碰撞解离。通过子离子扫描，得到碎片离子信息，再对去簇电压、碰撞电压等参数进行优化，使分子离子对的信号达到最强，每种化合物选择2 对分子离子对，以响应较强的子离子作为定量离子，另一子离子作为定性离子。化合物的质谱参数见表2。

2.2 色谱条件优化

由于甲醇和乙腈对绝大多数有机物具有较高溶解度，且二者具有低腐蚀性、低毒性、低粘性的特征，因此在液相色谱-质谱联用仪的使用中多采用甲醇或乙腈作为有机相。此外，常在流动相中加入乙酸铵，可以有效提高目标化合物的响应并改善峰型［22-23］分别以相同比例的乙腈-5 mmol／L 乙酸铵溶液和甲醇-5 mmol／L 乙酸铵溶液作为流动相进行试验，试验结果发现，在甲醇-5 mmol／L 乙酸铵溶液体系中，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素响应较高，但甲硝唑响应偏低；在乙腈-5 mmol／L 乙酸铵溶液体系中，氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素响应虽稍有下降，但甲硝唑响应值明显升高，因此选用乙腈-5 mmol／L 乙酸铵溶液作为流动相。

由于甲酸在水中电离产生正离子，向水相中加入甲酸可以增加正离子扫描模式下甲硝唑的离子化效率，提高灵敏度。分别考察了0.01%、0.05%、0.1%三种浓度甲酸作为流动相时，对甲硝唑及氯霉素类化合物响应值的影响。试验结果表明，甲酸浓度为0.05%时，在提高甲硝唑的离子化效率的同时，对氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的电离没有显著性影响，故B 相选用0.05%甲酸水溶液。

当样品溶液的溶剂与流动相溶剂对样品溶解度不同时，可能会造成峰展宽、峰分叉现象。为防止溶剂效应的发生，试验样品先加入0.1 mL 甲醇超声溶解残留物，再加入0.9 mL 体积分数为10%的甲醇-水溶液，混匀后进样。可有效防止溶剂效应，改善色谱峰峰型，提高响应值。

以乙腈-5 mmol／L乙酸铵溶液（含0.05%甲酸）为流动相，采用Kinetex C18柱（100 mm ×2.1 mm，2.6 μm，美国沃特世公司）对4 种抗生素混合标准溶液进行分离，结果表明，梯度洗脱比等度洗脱分析时间短、色谱峰宽更窄，且能够克服等度洗脱时待测物与干扰杂质一起流出，对待测物的离子化产生抑制作用以及色谱峰背景干扰的缺点。优化的梯度洗脱程序见表1。在优化条件下4 种抗生素提取色谱图如图1、图2 所示。

图1 氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素的提取色谱图

图2 甲硝唑的提取色谱图

2.3 前处理条件优化

食品样本分析过程中，样本的前处理较为费力、费时，同时明显影响分析结果的限速过程。氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素和甲硝唑属于弱极性物质，易溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂。通过考察证明，在3 种试剂中，乙酸乙酯提取率最高，因此选择乙酸乙酯提取样品。4 种抗生素需采用正负两种扫描方式，因此采用的固相萃取小柱需对阴阳离子均有所保留。Waters Oasis MCX 固相萃取小柱属于混合型阳离子交换反相吸附剂，其填料设计可以克服传统硅胶基质混合型固相萃取吸附剂的局限性，提供了离子交换和反相离子交换的双重保留模式。因此试验采用乙酸乙酯从MCX 柱洗脱获得氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素组分，采用5%氨化甲醇从MCX 柱洗脱获得甲硝唑组分，分级净化可有效去除干扰物质，满足要求。

2.4 同位素内标的使用

在质谱分析中，同位素内标法是以稳定同位素标记化合物作为内标，利用待测物与内标的响应丰度比值(峰面积比)进行线性回归，通过对同位素丰度的准确质谱测量和对加入的内标的准确称量，做到对待测物的定量测定。该技术能有效消除基质干扰、具有检测灵敏度高的优点。

2.5 线性关系与检出限

在1.2 仪器条件下测定1.3.2 配制的系列混合标准工作溶液，以待测化合物的质量浓度（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，得线性回归方程及相关系数。以3 倍信噪比对应的质量浓度作为方法的检出限。计算得到的线性范围、回归方程、相关系数及检出限结果列于表5。由表5 可知，4 种抗生素质量浓度与对应的色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.995，检出限为0.08 μg／L。

表5 回归方程、线性范围、线性相关系数与检出限

2.6 加标回收与精密度试验

准确吸取18 份空白蜂蜜5 g 作为本底，分别加入高、中、低三个质量浓度水平的混合标准溶液，每个浓度水平平行6 次测定，样品处理同前，上机测定，测定结果见表6。由表6 可知，4 种抗生素的平均加标回收率为90.2%～105.7%，测定结果的相对标准偏差为3.7%～8.9%，说明方法的精密度和准确度良好。

表6 4 种抗生素的加标回收、精密度试验结果

3 结语

建立了一种HPLC-MS／MS 方法同时检测蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素浓度，该方法对仪器条件和净化过程进行了优化，同位素内标的使用可减少基质效应的影响，具有检测快速、准确、检出限低、灵敏度高等特点，适用于蜂蜜中甲硝唑、氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留量的同时检测。