超高效液相色谱串联质谱法测定木贼中4 种吡咯里西啶生物碱

昝珂，陈翠玲，周颖，金红宇，马双成，王莹

（1.中国食品药品检定研究院，北京 102629； 2.梧州市食品药品检验所，广西梧州 543000；3. 浙江省食品药品检验研究院, 国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室, 杭州 310052）

木贼科植物木贼（Equisetum hyemaleL.），分布于我国北方多数省区，其干燥地上部分作为中药材木贼使用，具有疏散风热，明目退翳的功效，用于风热目赤，迎风流泪，目生云翳等疾病的治疗［1-2］，现有拨云退翳丸、复明片等中成药使用木贼作为处方药材。木贼主要含有挥发油、酚酸、生物碱、黄酮等多类化学成分［3-5］，近年有学者发现木贼中含有石松胺及其氮氧化物等吡咯里西啶生物碱（pyrrolizidine alkaloids，PAs）成分［6］，这些成分在肝脏中经细胞色素P450 酶水解后，均可生成相同的代谢产物脱氢吡咯，脱氢吡咯可与DNA 形成络合物导致基因突变，长期或过量摄入PAs 成分，可导致肝硬化或肝癌等严重疾病［7-10］。PAs 的肝毒性和致突变性已经引起西方发达国家有关部门的重视，出台了相关的限制措施［11］。2020 年12 月，欧盟发布了关于食品中PAs 的含量规定COMMISSION REGULATION(EU)2020／2040，草药中的最高限量为200 μg／kg，该法规适用于包括草药在内的所有食品原料，将于2022 年7 月1 日正式执行［12］。因此对其进行含量的检测有重要意义。

PAs 在植物中一般为痕量成分，并且紫外吸收不强，一般采用灵敏度高的液相色谱-质谱联用仪检测［13-15］。笔者发现木贼中除石松胺及其氮氧化物外，还存在蓝蓟定及其氮氧化物（结构式如图1 所示），为首次发现，且尚无其含量测定的报道。在之前研究的基础上，采用液相色谱-质谱联用法测定了木贼药材中石松胺及其氮氧化物、蓝蓟定及其氮氧化物4 个PAs 成分的含量，实验中为了富集目标成分，去除大多数干扰成分，样品前处理采用阳离子交换固相萃取小柱净化后配制供试品溶液，采用具有离子过滤功能、定量能力强的三重四级杆质谱进行检测，为该药材的安全性评价提供了科学数据。

图1 4 种吡咯里西啶生物碱的结构式

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪色谱仪：H-Class 型，美国沃特世科技公司。

三重四极杆串联质谱仪：Xevo TQ-S 型，美国沃特世科技公司。

超声波清洗器：KQ-250E 型，昆山市超声仪器有限公司。

电子天平：MSE125S 型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

超纯水系统：Milli-Q 型，美国密理博公司。

石松胺对照品：批号为89726，质量分数为99.11%，德国PhytoLab GmbH 公司。

石松胺氮氧化物对照品：批号为83447，质量分数为96.75%，德国PhytoLab GmbH 公司。

和蓝蓟定氮氧化物对照品：批号为83590，质量分数为98.81%，德国PhytoLab GmbH 公司。

蓝蓟定对照品：批号为21J080-P1，质量分数为93.13%，上海甄准生物科技有限公司。

甲醇、乙腈、甲酸铵、甲酸：质谱级，美国赛默飞世尔科技公司。

木贼样品：共6 批（编号分别标记为S1～S6），分别采自吉林、陕西省等地，样品S1～S6 经中国食品药品检定研究院中药所鉴定为木贼科植物木贼Equisetum hyemaleL.的干燥地上部分。

实验用水为超纯水。

1.2 对照品溶液的制备

精密称取石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定对照品适量，分别用甲醇-水溶液（体积比为1∶1）配成质量浓度分别为488、512、476和516 ng／mL 的单一对照品储备液。分别精密量取上述储备液各1 mL 置于同一25 mL 容量瓶中，用甲醇-水溶液（体积比为1：1）定容至标线，得到混合对照品溶液，质量浓度分别为19.52、20.48、19.04、20.64 ng／mL。

精密吸取石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定对照品单一对照品储备液0.02、0.04、0.1、0.2、0.5、1.0 mL，一一对应分别置于6 个10 mL 容量瓶中，加甲醇-水溶液（体积比为1∶1）稀释至标线，摇匀，即得系列混合对照品工作溶液。各组分质量浓度列于表1。

表1 系列混合对照品工作溶液质量浓度 ng／mL

1.3 样品溶液的制备

分别用5 mL 甲醇和5 mL 0.05 mol／L 硫酸溶液对SPE 柱进行洗脱，将上述续滤液上样。取木贼干燥药材，粉碎成细粉，过四号筛［孔径为(250±9.9)μm］，取粉末2.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入0.05 mol／L 硫酸溶液20 mL，密塞，称重，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）30 min，放至室温，再称定重量，用0.05 mol／L 硫酸溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取10 mL 续滤液进行固相萃取柱萃取，分别用5 mL 甲醇和5 mL 0.05 mol／L硫酸溶液对SPE 柱洗脱后将上述续滤液上样。待吸附后，分别用10 mL 甲醇和10 mL 8%氨水-甲醇溶液洗脱，收集氨水-甲醇溶液洗脱的流分，减压浓缩至约1 mL，加甲醇-水溶液（体积比为1∶1）稀释至5 mL，用0.22 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.4 色谱-质谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3 型色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，美国沃特世公司)；柱温：40 ℃；流动相：甲酸甲酸铵缓冲液（10 mmol／L 甲酸溶液-2.5 mmol／L 甲酸铵溶液）-酸化乙腈（95%乙腈水溶液，含10 mmol／L 甲酸溶液-2.5 mmol／L 甲酸铵溶液）（体积比为85∶15）；洗脱方式：恒流洗脱；流量：0.30 mL／min；进样体积：1 μL；电喷雾离子源：正离子多反应监测模式；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；去溶剂温度：500 ℃。4 种PAs 的质谱条件见表2，对照品和样品的色谱图见图2、图3。

表2 目标成分的MS 参数

图2 对照品混合溶液色谱图

图3 样品总离子流图

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件的选择

考察了ZORBAX SB C18型（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）、Acquity UPLC BEH C18型（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和ACQUITY UPLC HSS T3 型(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)色谱柱。结果表明，3 种色谱柱均能较好分离4 种PAs，CQUITY UPLC HSS T3 型色谱柱保留时间适中，峰形对称，故选择该色谱柱进行实验。

通常使用水与乙腈作为流动相，PAs 类成分为生物碱，流动相中添加甲酸和甲酸铵后有助于化合物质谱的检测。由于甲酸铵在纯乙腈中不溶，故在乙腈中加入5%的水作为有机相，可溶解少量甲酸铵。试验考察了甲酸和甲酸铵的添加量，由试验结果可知，分别向水相和有机相中添加10 mmol／L 甲酸溶液和2.5 mmol／L 甲酸铵溶液时，基线平稳、灵敏度最强并且峰形尖锐。同时考察了水相和有机相的洗脱比例，当体积比为85∶15 时，4 个化合物能够达到基线分离，并且保留时间适中。

2.2 质谱条件的选择

PAs 类生物碱在溶液状态下呈阳离子状态，选择正离子模式进行检测。通过“MS scan”模式进行扫描，选择最强的子离子作为定量离子，次强丰度的离子作为定性离子。选择仪器自带的“IntelliStart”模式优化最佳的锥孔电压和碰撞电压，结果见表2。

2.3 样品溶液制备条件优化

木贼中含有较多叶绿素、黄酮等成分，PAs 类为痕量成分，采用酸性水溶液即可提取出生物碱类成分，减少叶绿素等的溶出。试验考察了0.1 mol／L磷酸溶液、0.1 mol／L 盐酸溶液和0.05mol／L 硫酸溶液对PAs 的提取效率。试验结果表明，磷酸溶液的提取效率低于盐酸和硫酸，盐酸和硫酸有相似的提取率，但超声提取时盐酸有较强的挥发性，因此实验选择0.05 mol／L 硫酸溶液作为提取溶剂。

选用阳离子交换树脂型固相萃取技术小柱可去除大多数干扰成分，富集易形成阳离子的生物碱类成分，使待测成分易于分离和测定。试验比较了Cleanert PCX（天津艾杰尔科技公司）、Oasis MCX（美国沃特世公司）和Plexa PCX（美国安捷伦公司）3种强阳离子交换SPE 柱，结果表明，3 种柱均能满足含量测定要求，但Cleanert PCX SPE 柱的回收率更高，故选择该SPE 柱进行实验。

2.4 线性关系、检测限、定量限

取1.2 制备的系列混合对照品工作溶液，按照1.4 仪器工作条件进样测定。以对照品的色谱峰面积（Y）为纵坐标，4 种PAs 对应的质量浓度（X）为横坐标，进行线性回归。以3 倍定量离子色谱峰信噪比对应的最低质量浓度为检测限(LOD)，以10 倍定量离子色谱峰信噪比对应的最低浓度为定量限(LOQ)，结果见表3。由表3 可知，4 种PAs 在各自的质量浓度范围内与色谱峰面积线性关系良好。

表3 线性方程、线性范围、检测限和定量限

2.5 精密度试验

取样品粉末（编号S1），按1.3 方法处理，平行制备供试品溶液6 份，分别进行测定，计算石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定的含量，结果见表4。

表4 精密度试验结果

由表4 可知，石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定含量测定结果的相对标准偏差分别为2.7%、2.1%、2.3%、2.7%，说明该方法精密度较好，满足测定要求。

2.6 加标回收试验

精密量取石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定的单一对照品储备液适量，分别加甲醇-水溶液（体积比为1∶1），配制成4 种组分质量浓度分别9.76、51.20、19.04、10.32ng／mL 的混合对照品溶液。取S1 号样品的粉末6 份，每份约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入上述对照品混合溶液各1.0 mL，再加入19 mL 0.05 mol／L硫酸溶液，密塞，按照1.3 方法制备供试溶液，进样分析，计算回收率，结果见表5。由表5 可知，4 种组分的加标回收率为91.9%～97.1%，相对标准偏差分别为2.5%、3.2%、3.4%、2.9%，说明方法准确性良好。

表5 加标回收试验结果(n=6)

2.7 稳定性试验

取同一份供试品溶液(S1 号样品)，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样测定。结果显示，石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定色谱峰面积测定结果的相对标准偏差(n=6)分别为1.9%、1.6%、2.1%、2.4%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 样品测定

取各批次木贼药材各2.0 g，分别按供试品溶液制备方法操作，进样测定，按外标法计算石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定的含量，结果见表6。6 批木贼样品中的含量均未超过欧盟COMMISSION REGULATION (EU)2020／2040 草药中PAs 总量不大于200 μg／kg 的限量规定。

表6 样品含量测定结果(n=2) μg／kg

3 结语

建立了超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS）法测定了木贼中石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定4 种PAs 的含量。该方法灵敏度高、检测速度快、准确性好，可用于木贼药材中PAs 的快速测定，从而保证临床用药的安全性。所测6 批样品中石松胺、石松胺氮氧化物、蓝蓟定氮氧化物和蓝蓟定均有检出，因此应加强对木贼药材中PAs 的监测。