高效液相法测定化妆品中对乙酰氨基酚

张江维，张弦，肖树雄

(广东省药品检验所，广州 510663)

对乙酰氨基酚，又名扑热息痛，是一种常用的非甾体类抗炎药，具有解热、镇痛的作用，临床上常用来治疗感冒、发热及各种原因导致的疼痛等症状。非甾体类抗炎药一般为口服和外用，目前已上市了数10 种非甾体类抗炎药（NSAIDs）外用制剂，涵盖了8 种剂型、10 余种药物［1］。外用制剂作用机制与口服给药一致，当药物达到局部病灶部位后，通过抑制前列腺素合成过程中的COX 来抑制炎症［2-3］，可提供与口服相当的抗炎镇痛效力，且具有较轻微的全身不良反应。但不正当、长期或大量使用该药，可引起严重肝毒性，甚至导致急性肝衰竭［4-5］、哮喘［6］、高血压［7］、胃肠道及药疹或皮肤损害［8-9］等不良反应。

近年来在部分宣称护肤、保湿类护肤品的监督抽检中筛查出对乙酰氨基酚阳性化妆品。根据《已使用化妆品原料目录名称（2021 年版）》［10］中规定：“对乙酰氨基酚在淋洗类产品中最高历史使用量为0.05%，但未提供驻留类产品最高历史使用量（%）”、“对目录未提供最高历史使用量的原料，化妆品注册人、备案人可按照《化妆品安全评估技术导则》要求，提供相应的材料作为评估证据，或者按风险评估程序进行安全风险评估，确保原料的使用安全”。此次筛查出的两批对乙酰氨基酚阳性化妆品均属于驻留类产品且为婴幼儿类产品。化妆品中对乙酰氨基酚大致来源于以下情况，一是人为添加，少量添加可缓解产品成分的刺激或配合修复类产品以减少炎症对修复的影响；二是原料污染；三是生产药品时流水线上的药品残留。由于对乙酰氨基酚属于非甾体类抗炎药，会引起皮肤不良反应，对阿司匹林过敏的患者禁用，为保护人们身体健康，有必要对化妆品中对乙酰氨基酚含量进行检测。

目前对乙酰氨基酚常见检测方法有液相色谱法［11］、气相色谱法［12］、液相色谱-质谱法［13］、化学荧光法［14］、电化学方法［15］等，但大多数的相关方法报道主要集中在药品含量测定及临床研究、代谢组学［16］等方面，国内尚未有相关国家标准及文献报道关于化妆品中对乙酰氨基酚的检测研究，因此笔者建立高效液相色谱法和液质联用确证法（液相色谱-质谱联用法）测定凝胶、膏霜、化妆水、乳液类化妆品中对乙酰氨基酚含量，为化妆品监管提供技术支撑，同时也为后续相关研究工作提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：LC-20AT 型，配二极管阵列检测器，日本岛津公司。

三重四级杆质谱仪：LC／MS-8040 型，配岛津液相色谱仪（LC-30AD 型），日本岛津公司。

超声波清洗器：M8800H-C 型，美国Branson公司。

电子天平：MS204SM 型，感量值为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超纯水机：Milli-Q 2882 型，美国密理博公司。甲醇、乙腈：色谱纯，美国Honeywell 公司。

对乙酰氨基酚标准物质：纯度为99.9%（按C8H9NO2计），批号为100018-201610，中国食品药品检定研究院。

乙酸铵：色谱级，质量分数不小于99.0%，上海阿拉丁生化科技有限公司。

冰乙酸：色谱级，上海麦克林生化科技有限公司。

氨水：色谱级，天津市科密欧化学试剂有限公司。

护肤、保湿类、婴幼儿类化妆品样品：包含乳液、膏霜、化妆水、凝胶等，共48 批，市购。

实验用水为一级水。

1.2 溶液制备

对乙酰氨基酚标准储备溶液：质量浓度为1 000 μg／mL，称取对乙酰氨基酚标准物质50 mg（精确到0.000 1 g）至50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至标线。

对乙酰氨基酚系列标准工作溶液：取对乙酰氨基酚标准储备溶液适量，加入甲醇，配制成质量浓度分别为10、20、50、100、200、400 μg／mL 的系列标准工作溶液，待测。

0.01%氨水溶液：精密量取0.1 mL 氨水，加水定容至1 000 mL。

对乙酸铵溶液：0.02 mol／L，称取1.54 g 乙酸铵，加入950 mL 水，用冰乙酸调pH 至4.2，加水至1 000 mL，经0.45 μm 滤膜过滤。

甲醇-乙腈-乙酸铵溶液：分别取200 mL 甲醇、100 mL 乙腈和700 mL 0.02 mol／L 乙酸铵溶液，混匀，真空脱气，配成体积比为20∶10∶70 的混合溶液。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本OSAKA SODA 公司）；流动相：甲醇-乙腈-乙酸铵溶液（体积比为20∶10∶70）；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：245 nm；流量：1.0 mL／min；柱温：30 ℃；进样体积：5 μL。

对乙酰氨基酚对照品和阳性样品（从化妆品监督抽检中筛查出含对乙酰氨基酚的化妆品）色谱图见图1、图2。

图1 对乙酰氨基酚对照品色谱图

图2 对乙酰氨基酚阳性样品色谱图

1.3.2 液相色谱-质谱条件

（1）液相色谱。色谱柱：GL Sciences Inc.C18型(150 mm ×3.0 mm，3 μm，日本GL Sciences 公司)；柱温：30 ℃；流量：0.3 mL／min；进样体积：2 mL；流动相：A 相为0.01%氨水，B 相为甲醇，采用二元高压梯度洗脱，梯度洗脱程序列于表1。

表1 梯度洗脱程序

（2）质谱条件。电喷雾离子化源（ESI）；正离子模式；加热块温度：400 ℃；DL 管温度：250 ℃；雾化气流量：3 L／min；干燥气：N2，流量为15 L／min。质谱分析参数列于表2；离子源与相对丰度比图见图3。

表2 对乙酰氨基酚质谱分析参数

图3 对乙酰氨基酚离子源图

1.4 实验步骤

1.4.1 样品处理

（1）液相色谱法。称取样品1.0 g（精确到0.001 g）至10 mL 比色管中，加入甲醇定容，振摇分散均匀，超声20 min，用0.45 μm 滤膜过滤，滤液作为待测液。

（2）液相色谱-质谱法。称取样品0.2 g（精确到0.001 g）于50 mL 具塞离心管中，加入10 mL 甲醇涡旋混匀，超声提取15 min，以10 000 r／min 离心20 min，吸取2 mL 上清液于装有50 mg C18吸附剂的10 mL 具塞比色管中，涡旋2 min，经0.22 μm滤膜过滤，滤液作为待测液。

1.4.2 测定方法

取系列标准工作溶液及样品待测液分别按1.3.1 和1.3.2 条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

参考文献［11，17-18］及考察不同比例流动相。选择相同质量浓度的对乙酰氨基酚标准溶液，分别以乙腈-乙酸铵溶液（体积比为30∶70）、甲醇-乙腈-乙酸铵溶液（体积比为20∶10∶70，乙酸铵溶液均为0.02 mol／L，冰乙酸调pH 至4.2）作为流动相，进行对比试验。试验结果表明，以乙腈-乙酸铵溶液（体积比为30∶70）作为流动相时，对乙酰氨基酚色谱峰出峰时间较早，与溶剂峰有重叠，影响样品分析；以甲醇-乙腈-乙酸铵溶液（体积比为20∶10∶70）作为流动相时，对乙酰氨基酚色谱峰出峰时间延后，能达到分离要求，且对乙酰氨基酚易溶于甲醇，便于样品分析。因此选用甲醇-乙腈-乙酸铵溶液（体积比为20∶10∶70）作为流动相进行洗脱。

2.2 检测波长的选择

对对乙酰氨基酚标准溶液进行紫外吸收光谱扫描，由结果可知，对乙酰氨基酚在245 nm 波长处有较强吸收，故选用245 nm 作为对乙酰氨基酚的检测波长。经48 批样品检测验证，该波长条件下干扰较小，灵敏度较高，可满足检测方法需要。

2.3 提取溶剂的选择

参照《中国药典》2020 年版［17］对乙酰氨基酚“在热水或乙醇中易溶”和文献［19-20］，考察了不同提取溶剂对化妆品中非甾体类抗炎药的提取效果。试验选择乙醇、甲醇和70%甲醇溶液作为对乙酰氨基酚提取溶剂进行考察。

由试验结果可知，在凝胶类化妆品中，甲醇和乙醇提取效率无明显差异，70%甲醇溶液提取率较低；在膏霜类化妆品中甲醇提取效率最高，乙醇次之，70%甲醇溶液最低，且在实际操作中发现，对于膏霜类样品，使用70%甲醇溶液为提取溶剂时，样品过滤较为困难。考虑到不同基质类化妆品提取效率的差异和上机后存在的溶剂效应，选择甲醇作为提取溶剂。

2.4 超声提取时间的选择

选用膏霜类和凝胶类两批阳性样品为待测对象，在相同条件下分别选取不同超声时间（10、20、30 min）进行测定。

试验结果表明，对于膏霜类样品，当超声提取10 min 后提取效果无明显差异；对于凝胶类样品，超声提取时间对提取效果均无明显差异。考虑到产品基质的差异，故选取20 min 作为该方法的提取时间。

2.5 标准曲线与检出限

取1.2 中制备的系列标准工作溶液，按1.3 色谱条件进行测定。以待测组分质量浓度（x，μg／mL）为横坐标，相应的色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，采用线性回归法计算相关系数。由结果可知，对乙酰氨基酚的质量浓度在10～400 μg／mL范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性相关系数为0.999 9。

对对乙酰氨基酚标准溶液进行逐级稀释并检测，按照3 倍的信噪比计算检出限，得到对乙酰氨基酚的检出浓度为0.01 μg／mL，则相应检出限为0.1 mg／kg。线性范围、线性方程、相关系数、检出限列于表3。

表3 线性范围、线性方程、相关系数、检出限

2.6 加标回收率和精密度试验

选取化妆水、乳液、凝胶、膏霜4 种空白基质样品，每种基质分别添加4 个水平的对乙酰氨基酚标准储备溶液，每一个添加水平平行测定6 份，计算加标回收率和测定结果的相对标准偏差，结果见表4。

由表4 可知，样品加标回收率为97.73%～101.00%，测定结果的相对标准偏差为0.04%～0.74%，表明所建立的分析方法具有较好的准确度与精密度。

表4 4 种空白基质加标回收率和精密度试验结果

2.7 稳定性试验

为考察对乙酰氨基酚在整个实验过程中（24 h内）是否会降解或不稳定等，从而导致标准曲线不呈线性或样品出现假阴性等不利状况，对其进行稳定性试验。取1.2 中质量浓度为50 μg／mL 的对乙酰氨基酚标准溶液，分别在不同时间点进行测定，测得的色谱峰面积由线性回归方程计算得到实际测量浓度，并计算测定结果的相对偏差，结果见表5。由表5 可知，在24 h 内对乙酰氨基酚标准溶液的质量浓度无太大差异，表明标准溶液在室温放置24 h稳定性良好。

表5 对乙酰氨基酚24 h 内稳定性测定结果

2.8 样品测定

选取护肤、保湿类及婴幼儿类产品包含乳液、膏霜、化妆水、凝胶等共48 批化妆品样品进行检测，发现有两批样品检出对乙酰氨基酚，检出含量均为0.05%。两批阳性样品（某品牌修护凝胶和特护霜）使用说明均用于肌肤修护、滋养保湿及日常皮肤护理。为排除检测过程中的人为污染因素，重新对这两批同批号未开封样品进行检测，并对样品采用液相色谱-质谱联用法进行确证，两次检测结果无明显差异。因此，样品中的对乙酰氨基酚非检测过程中人为污染，均为生产带入。

3 结语

建立了化妆品中对乙酰氨基酚含量的高效液相色谱检测方法，并由液相色谱-质谱联用法对阳性样品进行确证。此方法简便、准确、灵敏度高、重现性好，适用于化妆品中对乙酰氨基酚的定量检测和结果确证。