舒尼替尼诱导自然杀伤细胞2族成员D配体表达对自然杀伤细胞杀伤舌鳞癌CAL27细胞敏感性的影响▲

朱冠宇 李阿峰 朱含九 李 楠

(1 海南省琼海市人民医院口腔科，琼海市 571400，电子邮箱：z26coolhao6t@163.com；2 陕西省商洛市中心医院口腔科，商洛市 726000；3 陕西省商南县中医医院口腔科，商南县 726300；4 海南医学院基础医学与生命科学学院，海口市 571199)

舌鳞癌是口腔常见的恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势[1]。临床研究发现，舌鳞癌患者的预后较差，5年生存率低于60%[2]。因此，探究舌鳞癌的发病机制，提高舌鳞癌患者的生存率，一直是临床研究的热点。舒尼替尼是一种新型多靶向性的肿瘤治疗药物，可通过抑制受体酪氨酸激酶的活性阻断肿瘤血管的生成及营养物质的供给，从而抑制肿瘤细胞的恶性增殖[3]。李金恒[4]发现，舒尼替尼通过阻断信号转导和转录激活因子3通路可抑制头颈癌细胞增殖；胡方宽等[5]发现，舒尼替尼可诱导食管癌细胞凋亡。但舒尼替尼在舌鳞癌发生和发展中的作用尚未有研究报道。而有研究显示，舒尼替尼可提高自然杀伤(natural killer,NK)细胞对肾透明细胞癌细胞的杀伤敏感性[6]。这提示舒尼替尼可能通过促进NK细胞的活化性受体与肿瘤细胞的NK细胞活化性受体的配体结合来提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。研究显示，舒尼替尼不仅可促进耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞表达活化性受体自然杀伤细胞2族成员D(natural killer group 2 member D，NKG2D)的配体(NKG2D ligand，NKG2DL)来抑制耐药鼻咽癌的免疫逃逸[7]，还可通过激活核转录因子кB旁路途径诱导人肝癌HepG2细胞NKG2DL的表达来增强NK 细胞的杀伤活性[8]。以上研究表明，舒尼替尼可通过提高肿瘤细胞NKG2DL的表达，增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤敏感性。本研究探讨舒尼替尼对舌鳞癌CAL27细胞增殖和凋亡的影响，旨在阐明舒尼替尼对CAL27细胞NKG2DL表达及NK细胞杀伤敏感性的影响，为舌鳞癌的抗肿瘤免疫逃逸的机制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 舌鳞癌CAL27细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所。RPMI-1640培养基(货号：12633012)、胎牛血清(货号：10100147)和胰酶(货号：25200072)购自美国Gibco公司。淋巴细胞分离液(货号：P8610)购自北京索莱宝生物科技有限公司。NK细胞培养基(货号：NK-92)购自上海语纯生物科技有限公司。细胞凋亡检测试剂盒(货号：88-8005-74)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。藻红蛋白标记的CD3(货号：741999)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的CD56(货号：559043)、MICA(货号：558352)、MICB(货号：558032)、ULBP1(货号：748133)、ULBP2(货号：748134)、ULBP3(货号：748128)、NKG2D(货号：563266)单抗、山羊抗鼠二抗(货号：682973)和兔抗鼠的二抗(货号：684963)均购自美国BD公司。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放检测试剂盒(货号：LM-4860-1)购自上海联迈生物工程有限公司。苹果酸舒尼替尼(货号：341031-54-7)购自美国辉瑞公司。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)购自Sigma公司(货号：P5368-10PAK)。FITC-膜联蛋白(Annexin)V(货号：P-CA-101)购自武汉普诺赛生命科技有限公司。结合缓冲液(货号：R2131)购自北京索莱宝科技有限公司。TBST(货号：T9039)购自Sigma公司。氯化氢(货号：R21766)购自上海尚宝生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 CAL27细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养；收集对数生长期的CAL27细胞，分为未处理组和舒尼替尼组，其中舒尼替尼组加入含1 μmol/L 舒尼替尼、10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养中，在37℃、5% CO2细胞培养箱中培养24 h，未处理组细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养24 h。

1.3 细胞克隆形成实验检测CAL27细胞的增殖能力 收集各组细胞，以每孔1×104个细胞接种于6孔板内，置于饱和湿度、37℃、5% CO2的培养箱中培养7 d后，观察细胞，弃上清，用PBS洗涤细胞，加入1 mL体积分数为4%的多聚甲醛，4℃固定细胞1 h，PBS洗涤细胞后，加入1 000 μL的结晶紫染色液作用细胞2 min，加入1 mL双蒸水(double distilled H2O，ddH2O)洗涤细胞。晾干后，采用倒置显微镜(×200)观察细胞克隆数目，计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数目/接种细胞数目×100%，实验重复3次。

1.4 流式细胞术检测CAL27细胞凋亡及NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3)的表达 用胰酶将各组细胞消化后，在4℃、12 000 r/min条件下离心5 min，然后用-20℃预冷的PBS洗涤细胞。避光条件下，加入10 μL FITC-Annexin V和5 μL碘化丙啶，静置15 min，加入500 μL结合缓冲液混匀后置于冰上，利用流式细胞仪(Thermo Scientific公司，型号：A24863)检测细胞凋亡情况。其中，设未加抗体的细胞为空白对照组。细胞凋亡率=Annexin V(+)碘化丙啶(-)细胞/所有细胞，细胞经Annexin V和碘化丙啶染色后，流式细胞术分析可产生明显的细胞分群，根据细胞分群圈门确定凋亡细胞数量，Annexin V(+)且碘化丙啶(-)的细胞为凋亡细胞。收集各组CAL27细胞，利用PBS洗涤并重悬细胞，调整细胞浓度为5.5×104个/mL后，接种于96孔板内。根据1 μg/106个细胞分别加入2.0 μL MICA、1.6 μL MICB、3.5 μL ULBP1、1.7 μL ULBP2和2.3 μL ULBP3抗体，每孔设置5个复孔，4℃孵育细胞25 min，PBS洗涤细胞，加入5 μL FITC标记的山羊抗鼠二抗，4℃孵育30 min，PBS洗涤3次，利用流式细胞仪分析阳性细胞，荧光一抗所标记的发光细胞为阳性细胞。实验重复3次。

1.5 NK细胞分离及纯度鉴定 根据淋巴细胞分离液的操作说明分离4例健康人(志愿者)外周血获得单个核细胞，加入NK细胞培养基置于37℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。PBS洗涤重悬NK细胞，调整细胞浓度至1×107个/mL，依次加入10 μL藻红蛋白标记的CD3抗体、10 μL FITC标记的CD56抗体，室温避光条件下孵育20 min后，采用PBS重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/100 μL，利用流式细胞仪检测NK细胞表型。实验重复3次。NK细胞纯度=CD3-CD56+细胞/所有活细胞，细胞经CD3和CD56染色后，流式细胞术分析可产生明显的细胞分群，根据细胞分群圈门确定NK细胞(即CD3-CD56+细胞)数量。

1.6 蛋白免疫印迹法检测MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3蛋白表达 采用RIPA细胞裂解液裂解各组CAL27细胞，提取细胞总蛋白，利用二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)法检测细胞蛋白浓度。取95℃高温变性后的150 μg蛋白，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离等量蛋白，将蛋白转至聚偏氟乙烯膜。5%脱脂牛奶4℃封闭1 h，用TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5.0 μL MICA(1 ∶1 000)、4.2 μL MICB(1 ∶1 200)、3.3 μL ULBP1(1 ∶1 500)、5.0 μL ULBP2(1 ∶1 000)和3.3 μL ULBP3(1 ∶100)抗体，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，5 min/次，然后加入5 μL辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠的二抗(1 ∶1 000)，37℃孵育1 h，TBST洗膜5次，5 min/次。以GAPDH(1 ∶3 000)为内参蛋白，显影曝光后，利用Image-Pro Plus图像分析软件对蛋白条带的灰度值进行分析。实验重复3次。

1.7 LDH释放法检测NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性 收集未处理组的CAL27细胞与舒尼替尼组的CAL27细胞，并将其设为靶细胞，用无胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬两组细胞，倒置显微镜(×100)下计数，调整细胞浓度至4×105个/mL。收集1.5中的NK细胞，PBS洗涤重悬细胞，调整细胞浓度至1×105个/mL，将NK细胞分为NKG2D单抗组和对照组，NKG2D单抗组加入NKG2D单抗(5.0 μL MICA、5.0 μL MICB、2.5 μL ULBP1、2.5 μL ULBP2和2.5 μL ULBP3)与50 μL NK细胞孵育20 min，对照组不加入NKG2D单抗孵育。再将舒尼替尼组的CAL27细胞分为舒尼替尼-NKG2D组和舒尼替尼-对照组，舒尼替尼-NKG2D组加入NKG2D单抗组的NK细胞，舒尼替尼-对照组加入对照组的NK细胞，同时未处理组加入对照组的NK细胞(作为未处理-NK组)，并将加入NK细胞处理的CAL127细胞设为效应细胞。利用无胎牛血清的RPMI-1640培养基重悬各组效应细胞，倒置显微镜(×200)下计数，调整效应细胞密度至2×106个/mL、4×106个/mL及8×106个/mL。按照效靶比为5 ∶1、10 ∶1及20 ∶1将效应细胞及靶细胞加入96孔板内，按LDH试剂盒操作说明书设为实验组。同时设置效应细胞自然释放组、靶细胞自然释放组及靶细胞最大释放组，效应细胞自然释放组加入效应细胞和培养液各100 μL，靶细胞自然释放组加入靶细胞和培养液各100 μL，靶细胞最大释放组加入靶细胞和效应细胞各100 μL。每组各设置6个复孔。将96孔板置于37℃、5% CO2的培养箱孵育6 h，4℃条件下12 000 r/min离心5 min后，每孔吸取100 μL细胞上清置于96孔板内，加入100 μL LDH溶液反应5 min后，加入1 mol/L的氯化氢溶液30 μL，利用酶标仪(中国赛默飞世尔科技公司，型号：51119570)在490 nm处检测光密度值(OD值)。计算NK细胞的杀伤活性，NK细胞的杀伤活性=(实验组OD值-效应细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)。实验重复3次。

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 舒尼替尼对舌鳞癌CAL27细胞增殖和凋亡的影响 细胞克隆形成实验结果显示，与未处理组相比，舒尼替尼组的CAL27细胞克隆形成率降低(P<0.05)。流式细胞术实验结果显示，与未处理组相比，舒尼替尼组的CAL27细胞的凋亡率增加(P<0.05)，见表1和图1、图2。

表1 舒尼替尼对舌鳞癌CAL27细胞增殖和凋亡的影响(x±s，%)

图1 舒尼替尼对CAL27细胞增殖的影响

图2 舒尼替尼对CAL27细胞凋亡的影响

2.2 NK细胞纯度的鉴定 流式细胞术实验结果显示，CD3-CD56+的NK细胞纯度在90%以上，见图3。

图3 CD3-CD56+的NK细胞注：左图和中图代表NK细胞的分选方法，左图为淋巴细胞分选，中图为CD3-CD56+的NK细胞分选。右图为NK细胞的纯度检测。

2.3 舒尼替尼对CAL27细胞NKG2DL蛋白表达水平的影响 蛋白免疫印迹实验和流式细胞术实验结果均显示，与未处理组相比，舒尼替尼组的CAL27细胞中的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2蛋白表达水平、阳性细胞数均升高(均P<0.05)，而ULBP3蛋白表达水平、阳性细胞数未出现明显变化(P>0.05)，见表2、图4、图5。

表2 舒尼替尼对CAL27细胞NKG2DL蛋白表达水平的影响(x±s)

图4 舒尼替尼对CAL27细胞NKG2DL蛋白表达的影响(A为未处理组，B为舒尼替尼组)

图5 舒尼替尼对CAL27细胞NKG2DL蛋白表达的影响注：A为MICA，B为MICB，C为ULBP1，D为ULBP2，E为ULBP3。

2.4 舒尼替尼对NK细胞杀伤CAL27细胞的敏感性的影响 LDH实验结果显示，与未处理组-NK相比，不同效靶比下，NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性均增强(均P<0.05)，见表3。

表3 舒尼替尼对NK细胞杀伤CAL27细胞敏感性影响的比较(x±s，%)

2.5 NKG2D抗体对NK细胞杀伤舒尼替尼处理的CAL27细胞的敏感性影响 LDH实验结果显示，不同效靶比下，与舒尼替尼-对照组比较，舒尼替尼-NKG2D组CAL27细胞的杀伤敏感度降低(均P<0.05)，见表4。

表4 NKG2D抗体对NK细胞杀伤CAL27细胞敏感性的影响(x±s，%)

3 讨 论

舌鳞癌是口腔癌中最易发生淋巴转移的肿瘤，由于生活方式和环境的改变，舌鳞癌的发病率持续升高[9]，发病率位列全身恶性肿瘤的第六位[10]。目前，临床针对舌鳞癌的治疗是以手术为主、放化疗为辅的综合治疗，但治疗效果不理想，因此探究药物治疗舌鳞癌的作用机制，对临床治疗舌鳞癌具有重要意义。

舒尼替尼是一种小分子吲哚酮化合物，可抑制血小板源性生长因子受体、血管内皮生长因子受体、原癌基因c-kit、fms相关酪氨酸激酶3和ret原癌蛋白的活性，同时抑制肿瘤血管生成，导致肿瘤细胞凋亡和肿瘤萎缩，是临床应用广泛的抗肿瘤药物[11]。近年有研究显示，舒尼替尼可以抑制肿瘤细胞增殖并促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤的发生和发展。Korashy等[12]发现，舒尼替可抑制乳腺癌细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡；Thakur等[13]发现，舒尼替尼可通过抑制内质网应激介导的自噬促进胰腺癌细胞的自噬。本研究结果显示，与未处理组相比，舒尼替尼组CAL27细胞的克隆形成率降低、凋亡率增加(P<0.05)，这提示舒尼替尼可抑制舌鳞癌CAL27细胞的增殖，促进CAL27细胞的凋亡，说明舒尼替尼具有抑制舌鳞癌发生和发展的作用。

NK细胞是机体抗肿瘤免疫的重要淋巴细胞，当其活化性受体NKG2D与肿瘤细胞的NKG2DL结合，给予NK细胞强烈的活化性信号，促使NK细胞杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞的免疫逃逸[14]。NKG2DL是NKG2D的相应配体，包括MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3等，其表达的变化直接影响NK细胞对肿瘤细胞的杀伤性。随着对机体抗肿瘤免疫机制研究的不断深入，发现肿瘤细胞可通过降低其NKG2DL的表达逃避NK细胞的免疫杀伤，促进自身的发生和发展[15]。因此，提高肿瘤细胞NKG2DL的表达，是抑制肿瘤细胞免疫逃逸的关键。研究发现[8]，舒尼替尼可促进肝癌细胞表达NKG2DL(MICA、MICB和ULBP2)，提高NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性。这说明舒尼替尼具有抗肿瘤免疫逃逸的功能。本研究结果显示，与未处理组相比，舒尼替尼组的CAL27细胞中的MICA、MICB、ULBP1和ULBP2蛋白表达水平均升高，且NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性增强(均P<0.05)，这提示舒尼替尼可促进CAL27细胞NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1和ULBP2)的表达，增强NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性。此外，利用NKG2D抗体作用于NK细胞，发现NK细胞对经舒尼替尼处理的CAL27细胞的杀伤敏感性降低(P<0.05)。这提示舒尼替尼能够促进CAL27细胞NKG2DL的表达，NKG2D与NKG2DL结合后增强了NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性。

综上所述，舒尼替尼可抑制舌鳞癌细胞CAL27细胞的增殖，促进其凋亡，并通过促进CAL27细胞NKG2DL(MICA、MICB、ULBP1和ULBP2)的表达来增强NK细胞对CAL27细胞的杀伤敏感性，为临床进一步探究舌鳞癌的免疫治疗提供了新的思路。