胡萝卜中番茄红素的提取、测定和应用研究

李长滨，王钊

(河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046)

番茄红素又称茄红素，是类胡萝卜素的一种，广泛存在于番茄、木瓜、葡萄柚等水果中，属于脂溶性色素，不溶于水，难溶于强极性溶剂(甲醇、乙醇)，易溶于氯仿和苯，是一种脂溶性不饱和碳氢化合物[1]。番茄红素的抗氧化能力极强，具有极强的抗紫外线作用，可有效缓解紫外线过敏患者的症状，番茄红素还有抗炎、抗肿瘤、降血压、降血脂的作用，在食品、化妆品、医药、保健品等方面得到广泛应用[2-3]。

番茄红素的提取方法主要有超临界CO2萃取、有机溶剂提取、超声波辅助提取、超声-微波辅助提取、酶反应提取等[4-8]；番茄红素的检测方法主要有分光光度法、薄层色谱法、液相色谱法等[9-11]。紫外可见分光光度法相对简单，但系统误差较大，需要消除样品中其余类胡萝卜素的影响；薄层色谱法具有较好的专一性，但容易导致人为误差，影响结果的准确性；高效液相色谱法简单方便，干扰因素少，适用于番茄红素的提取和定性定量分析。本试验拟对比水浴加热提取、超声波提取和微波提取3种提取方法的优劣，建立番茄红素的高效液相检测方法，并以酸价和过氧化值为指标来评价番茄红素的应用效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡萝卜、绿茶饮料：购于郑州丹尼斯超市；番茄红素标准物质(标准品)：国家标准物质中心；甲醇、乙腈、二氯甲烷(色谱纯)、乙酸乙酯、无水硫酸钠、石油醚、无水乙醇、2,6-二叔丁基对甲苯酚、冰乙酸、异辛烷、碘化钾、淀粉、硫代硫酸钠(分析纯)：国药集团化学试剂有限责任公司。

1.2 主要仪器与设备

HC-331电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；AL-MUC1型微波仪 北京一叶蓝天科技有限公司；HH-1超声水浴锅 江苏盛蓝仪器制造有限公司；MZQ 500型超声波清洗仪 昆山市超声仪器设备有限公司；HC-1016高速离心机 浙江纳德科学仪器有限公司；1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；T960自动电位滴定仪 济南海能仪器设备有限公司；T1901紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 色谱条件

色谱柱：安捷伦C18色谱柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相：甲醇∶乙腈∶二氯甲烷为20∶75∶5(体积比)；流速：1 mL/min；检测波长：475 nm；进样量：20 μL；柱温：25 ℃。

1.4 方法

1.4.1 提取溶剂的选择

将胡萝卜洗净、切块，放入粉碎机内处理成糊状，装入试验用自封袋中，避光保存，待用。称取5.00 g样品后加入30 mL不同的提取剂，置于振荡器上振荡10 min后，300 W超声30 min，再次于振荡器上振荡5 min，以3500 r/min离心5 min后过膜，测定吸光度。

1.4.2 提取工艺的研究

考察水浴加热提取、超声波提取和微波提取3种提取工艺的参数，水浴加热提取法从提取时间、提取温度、料液比方面进行分析，采用正交试验优化水浴加热法提取番茄红素的工艺，水浴加热提取法正交试验因素与水平设计见表1。

表1 水浴加热提取正交试验因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test of water bath heating extraction

超声波提取法从超声时间、超声功率、超声温度和料液比几个方面进行分析以得到最优的工艺，超声波提取法正交试验因素与水平设计见表2。

表2 超声提取正交试验因素水平Table 2 The factors and levels of orthogonal test of ultrasound extraction

微波提取法从微波功率、微波时间、料液比几个方面进行分析，微波提取法正交试验因素与水平设计见表3。

表3 微波提取正交试验因素水平Table 3 The factors and levels of orthogonal test of microwave extraction

1.4.3 酸价的测定[12]

取一个250 mL锥形瓶，称量20.00 mL左右混合均匀的供试品，加入50 mL石油醚(30～60 ℃)，放入磁力搅拌子，然后在磁力搅拌器上搅拌20 s以上，直至试样完全溶解形成溶液，采用自动电位滴定仪进行滴定，根据滴定体积计算。

1.4.4 过氧化值的测定[13]

取5.00 g样品于滴定仪的滴定杯中，将50 mL乙酸异辛烷溶液加入滴定杯中，盖上盖子摇动至样品溶解。将0.50 mL饱和碘化钾溶液加入，盖上盖子反应1 min，在此期间摇动滴定杯3次以上，而后立刻将30 mL蒸馏水倒入。采用电位滴定法用硫代硫酸钠溶液自动滴定到终点，滴定过程中增加0.5 mL左右的淀粉溶液，根据所耗费的硫代硫酸钠溶液体积计算。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂对提取的影响

根据番茄红素的溶解性特点以及有机溶剂的特性，选择石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、环己烷5种试剂作为提取溶剂[14]，不同提取溶剂对番茄红素提取的影响见图1。

图1 不同提取溶剂对番茄红素提取率的影响Fig.1 Effect of different extraction solvents on the extraction rate of lycopene注：1，2，3，4，5分别表示石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮和环己烷。

由图1可知，乙酸乙酯对番茄红素提取率的影响最大，其次为丙酮。乙酸乙酯相比价格低且毒性小，所以试验选择乙酸乙酯为提取溶剂。

2.2 不同提取工艺研究

2.2.1 水浴加热法工艺研究

根据单因素试验结果选取温度、时间、料液比3个因素及其对应的3个水平进行正交试验，正交试验结果见表4。

表4 水浴加热提取正交试验结果Table 4 The orthogonal experimental results of water bath heating extraction

由表1和表4可知，当使用乙酸乙酯提取番茄红素时，3个因素的影响大小顺序为C>A>B，C因素即料液比对胡萝卜中番茄红素提取率的影响较大，由表4可知最佳组合为A3B2C1，用乙酸乙酯采用水浴加热法提取胡萝卜中番茄红素的最佳条件为：提取时间80 min，提取温度45 ℃，料液比1∶3，提取率为0.196 mg/g。

2.2.2 超声波提取工艺研究

为了加快提取速度，实验室常用超声波提取法辅助提取番茄红素。超声波可以加快番茄红素在提取剂中的溶解，从而减少番茄红素暴露在日光和空气中的时间，避免番茄红素的氧化，超声波提取从超声时间、超声功率、超声温度和料液比几个方面进行正交试验，正交试验结果见表5。

表5 超声提取正交试验结果Table 5 The orthogonal experimental results of ultrasound extraction

由表5可知，超声波辅助法提取番茄红素时，影响提取效果的因素顺序为:超声功率>料液比>超声温度>超声时间，最优化工艺为 A2B2C1D1，即超声时间15 min、超声功率200 W、超声温度40 ℃、料液比1∶4(g/mL)时番茄红素的提取率最高，提取率为0.362 mg/g。

2.2.3 微波提取工艺研究

微波提取法以其提取速度快、成本低、提取效率高等优点，也被广泛用于辅助提取。微波提取从微波功率、微波时间、料液比几个方面进行分析，微波提取正交试验结果见表6。

表6 微波提取正交试验结果Table 6 The orthogonal experimental results of microwave extraction

由表6可知，采用微波法提取番茄红素，影响提取效果的因素顺序为：微波功率>微波时间>料液比，最优工艺为A1B2C2，即微波时间50 s、微波功率400 W、料液比1∶4(g/mL)时番茄红素的提取率为0.310 mg/g。

对比3种提取方法，超声波辅助提取和微波辅助提取两种方法提取率接近，超声波辅助法的提取率略高于微波辅助法的提取率，水浴加热法的提取率最低且提取时间最长。可能原因为超声波的空化效应和微波提取的高频性增加了分子运动的速度和频率，能够使细胞内部溶解的番茄红素提取出来，而采用水浴加热方法，提取剂不能很好地穿透细胞壁，无法提取内部番茄红素[15-16]。

2.3 番茄红素测定方法的建立

2.3.1 番茄红素标准曲线的绘制

准确称取10.00 mg番茄红素标准品，用乙酸乙酯溶解，定容至100 mL，得100 μg/mL储备液。精密吸取0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL储备液于100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯稀释至刻度，获得0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 μg/mL的标准品溶液。以标准品吸光度对浓度作线性曲线。标准曲线回归方程为：y=0.1442x-0.0179，相关系数R2为0.9994，番茄红素标准溶液浓度与吸光度值存在良好的线性关系，样品在0.2～5.0 μg/mL范围内呈良好的线性关系，最低检出限为0.2 μg/mL。

2.3.2 胡萝卜中番茄红素的测定

取胡萝卜样品，用超声波辅助提取最优方案进行提取，采用高效液相色谱法进行测定并进行加标回收试验，加标浓度分别为0.2，0.4 mg/g，每个水平平行测定6次，测定结果RSD在1.08%～3.07%之间，加标回收率范围在96.5%～105%，试验结果见表7。

表7 胡萝卜中番茄红素测定结果Table 7 The determination results of lycopene in carrot

2.3.3 番茄红素的氧化性研究

为了评价番茄红素对食品的抗氧化性能，以绿茶为分析对象，在第7天、第14天和第21天用自动电位滴定法测定未添加番茄红素和添加番茄红素的酸价和过氧化值，从而判断番茄红素对饮料的影响，具体结果见表8。

表8 绿茶中番茄红素添加前后酸价和过氧化值测定结果Table 8 The determination results of acid value and peroxide value of green tea before and after adding lycopene

由表8可知，添加番茄红素的饮料相对未添加番茄红素的饮料，酸价和过氧化值均有所减小，特别是过氧化值降低幅度在70%左右，说明在相同条件下番茄红素对饮料具备一定减缓氧化的功能。酸价测定平均相对标准偏差为0.46%，过氧化值测定平均相对标准偏差为0.71%。

3 结论

试验以胡萝卜为分析对象，考察了不同溶剂对胡萝卜中番茄红素提取效果的影响，得出了乙酸乙酯作为提取剂提取效率最高的结论；评价了不同条件下水浴加热、超声波辅助提取、微波辅助提取对胡萝卜中番茄红素的影响，发现超声波提取效果最好，其次为微波提取，水浴加热提取效果最差，且得到了每种提取方法的最优工艺，为番茄红素的提取和加工提供了有力的支撑；建立了高效液相色谱法测定番茄红素的方法并对该方法进行了评价，结果表明，番茄红素在0.2～5.0 μg/mL浓度范围内线性良好，R2为0.9994，仪器检出限为0.2 μg/mL。最后将提取的番茄红素添加到饮料中，通过测定不同时期饮料的酸价和过氧化值来评价番茄红素的抗氧化作用。结果显示：添加番茄红素的饮料的酸价和过氧化值都比未添加的低，且测定结果均符合国家标准，为番茄红素的应用提供了参考依据。