广西武宣地区红曲米挥发性风味组分分析

罗佳沂，李洋，杨琪，李慧敏，覃丽，毛瑞丰，李凯

(广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530004)

红曲霉菌属是一种小型丝状腐生真菌，1884年由Van Tieghem命名[1]，具有良好的耐酸和耐乙醇能力。红曲霉不仅可以酿造红曲酒、烹饪饮食、发酵食品[2-4]，同时，它的代谢产物Monacolin K具有降低胆固醇和防止心血管疾病的活性物质[5]，在我国已有超过千年的使用历史。红曲米是以籼稻为原料，接种红曲霉菌发酵而成的棕红色或紫红色不规则颗粒。在我国有些地方也称之为“丹曲”、“赤曲”、“红米”等[6-7]。大多数学者以大米为发酵基质做红曲米，也有少数学者使用玉米粒、糙米等[8]。根据红曲米的用途不同，可将其分为三大类别：轻曲、库曲、色曲。

我国红曲产品主要分布在福建、浙江、台湾、江西、广东、山东等地，其中福建的古田红曲、乌衣红曲较为出名。广西武宣地区的红曲米虽历史悠久，但生产基本上还处于传统的小规模作坊式水平。相比于福建红曲，广西红曲米因知名度较小，较少有学者对其进行研究。目前对红曲的研究主要集中在其代谢产物Monacolin K、洛伐他汀、桔霉素以及产色素和发酵食品等方面，少有对红曲风味的研究[9]。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)是检测食品风味组分的实用技术，相比于传统的检测方法，其具有灵敏度高、检测时间短、样品用量少的特点[10]。本研究采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对广西武宣地区8种红曲米的风味组成进行解析，结合主成分分析法(PCA)，进一步研究武宣地区红曲米的各种挥发性成分对其整体风味的贡献程度，为了解广西红曲米的风味构成、进一步对其品质进行探索提供了依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

7890B GC-5977A MSD型气相色谱-质谱联用仪、DB-Wax弹性石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美国Agilent公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR on PDMS)萃取头 美国Supelco公司；白米、红曲米 广西来宾市武宣县。

表1 红曲米的采样点Table 1 The sampling sites of red yeast rice

1.2 方法

1.2.1 红曲米制作工艺

由图1可知，广西武宣红曲米以白米为原料，蒸熟米饭后加入用白醋泡发的干红曲米米浆，充分拌匀后自然发酵。发酵过程的前12 h盖布保温，12 h后揭开布继续发酵。发酵24 h时，洗米2次，晾干至不滴水且内部发热，在发酵24 h时，再次洗米，晾干后即为红曲米。

图1 工艺流程Fig.1 The technological process

续 表

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1.2.2 挥发性风味组分分析

GC条件：DB-Wax毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；载气为氦气(He)，流速为20 mL/min，不分流进样；进样口温度为240 ℃；起始温度为40 ℃，保持5 min后以2 ℃/min的速度升温至120 ℃，随后将升温速度改为4 ℃/min，当温度升至240 ℃时保留5 min；后运行温度设为240 ℃，后运行时间为5 min。

MS条件：电子电离(electronic ionization，EI)，电子能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，连接杆温度为150 ℃。采用全扫描模式收集信号，扫描范围为33～550 m/z。

香气成分的提取：取2.5 g待测样品装入20 mL的萃取瓶中密封后置于60 ℃水浴锅中平衡30 min，将老化的萃取头插入样品瓶中，顶空萃取30 min。

1.2.3 数据分析1.2.3.1 定性方法

将检测得到的物质谱图与标准谱库NIST 11和Wiley进行比对检索，结合保留指数相关文献及书籍资料的查询，准确鉴定出武宣地区红曲米香气中的各个化学成分。

1.2.3.2 主成分分析

采用R语言软件，根据相关成分的相对含量、特征根以及特征向量，计算各主成分值，并以此做PCA图和载荷图[11]。

2 结果与分析

2.1 广西武宣地区红曲米挥发性风味物质组成分析

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)检测了白米和广西武宣地区8种红曲米的挥发性风味组分，由表2可知，BM中共鉴定出68种挥发性风味物质，其中酯类6种、酮类6种、醇类4种、酸类1种、醛类13种、酚类5种、吡嗪类2种、烷烃类7种、醚类4种、其他化合物20种。红曲米中共鉴定出95种挥发性风味物质，其中酯类18种、酮类17种、醇类14种、酸类12种、醛类4种、酚类8种、吡嗪类6种、烷烃类4种、醚类3种、其他化合物9种。

表2 白米中主要挥发性物质检出结果Table 2 The detection results of main volatile substances in white rice

由表3可知，GS1、GS2、GS3、GS4、GS5、SL、HM、HT分别检出55，46，45，46，61，63，46，47种挥发性成分，其中，SL检测出的化合物数量最多，GS3检测出的化合物数量最少。

表3 武宣地区红曲米中挥发性物质检出结果Table 3 The detection results of volatile substances in red yeast rice in Wuxuan region

本次试验白米检出的挥发性组分中，醛类、其他类、酚类物质的占比较高，醛类物质的相对含量占比为52.44%，是白米风味物质中的主要成分，包含己醛、正辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、癸醛、苯甲醛、苯乙醛等，这些物质多具有茉莉、水仙花等令人愉悦的花香。3-糠醛是含量最高的醛类物质，其次是5-甲基呋喃醛，分别占总含量的26.58%和12.45%。3-糠醛可以作为香精油、化妆品或药物的中间体，有杏仁气味。5-甲基呋喃醛是通用食用香料的一种重要组成，也是2,5-二甲基呋喃的重要中间体，具有芳香的气味[12]。酚类物质是白米风味物质中的重要成分，相对含量占比为12.76%，其中2,6-二叔丁基对甲酚在总含量占比达到11.76%，具有烘烤的气味。张敏等[13]对不同品种稻米的风味进行了研究，发现醛类在稻米所有风味化合物类别中占比最大，是主要风味物质，其检测出了稻米中含有辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、2-戊基呋喃等，与本研究的检测结果相同。

本次试验红曲米检出的挥发性组分中，酸类、醇类、酮类、酯类物质的占比较高。红曲米中的乳酸菌在发酵过程中会生成一些有机酸，如乙酸、己酸、戊酸等，其相对含量较高，是广西武宣地区红曲米中重要的呈味物质[14]。8种红曲米中检出的醇类物质多为C6-C8的低碳链醇，其中1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草的香气，2-庚醇呈柠檬和青草香，苯乙醇具有玫瑰花香，这些醇类物质赋予红曲米醇香、花香的气味。酮类是大米中非常重要的挥发性风味组分[15]，其通常来自于发酵过程中多不饱和脂肪酸的氧化或热降解、氨基酸的降解或微生物的氧化[16]。本次试验检出的酮类物质中，多具有水果、牛奶和药草的香气，如2-庚酮具有干酪、香蕉的香气，甲基壬基甲酮呈柑橘类、油脂香，香叶基丙酮具有木兰香气，略带玫瑰香。酯类物质是酵母或丝状真菌在发酵时期的代谢产物，通过脂肪酸酯化得来[17]，如甲酸己酯、醋酸辛酯等酯类化合物，对广西武宣地区红曲米中的果香香气有贡献。

进一步对红曲米中定性的化合物进行对比分析，发现武宣地区不同乡镇生产的红曲米中挥发性风味组分存在显著性差异。由图2可知，根据各类挥发性物质的相对含量占比，对A村地区红曲米的香气贡献最大的是酸类，其次是醇类和酯类，贡献最少的是醚类；对B村地区红曲米的风味而言，占据主导位置的物质是醇类，其次是酮类；C村和D村生产的红曲米，风味物质的含量大体相同，但C村贡献最大的物质是酮类，而D村是醇类，其次均为吡嗪类。由此可见，广西武宣地区红曲米风味化合物的种类大体相同，但不同村落生产的红曲米在起关键风味作用的化合物上存在差异。

图2 武宣地区不同村落红曲米中挥发性物质种类分布Fig.2 The distribution of volatile substances in red yeast rice from different villages in Wuxuan region

图3直观地表现了8种红曲米中各种挥发性组分相对含量的相对丰度。对红曲米风味物质丰度进行标准化层次聚类后得到相对丰度，数字越大表示相对含量越高[18]。由图3可知，GS4红曲米中，特有的挥发性物质是乙酸己酯、3-辛烯-2-酮、2-十四烷醇、对甲基苯甲酸甲酯和丙位辛内酯，其中乙酸己酯赋予GS4梨和苹果的香气，丙位辛内酯为其增添了药草和椰子的风味。GS2红曲米含有的甲酸己酯，使其具有苹果和未成熟梅子的甜香。N-氨基四氢吡咯、α-戊基-γ-丁内酯、(±)-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、2-茨酮、癸酸、2-哌嗪酮、丙位庚内酯这些化合物只存在于A村所产的红曲米中，在其他村落所产红曲米中没有检测到。SL红曲米中，酮类化合物的种类最多，因此其风味中，干酪和油脂的香韵较浓郁。且2,5-二叔丁基酚、棕榈酸是只存在于SL红曲米中的挥发性物质。HM和HT红曲米中，2,6-二甲基吡嗪和2-庚酮的含量较高，可能是这些化合物的协同作用，导致不同村落所产红曲米的特征香气存在差异。A村红曲米的香气倾向于果香；B村红曲米的香气倾向于脂香和花香；C村和D村红曲米的香气倾向于烘焙香型。8种红曲米中均检出的挥发性风味组分为2,6-二甲基吡嗪、十六烷、壬醛、十四烷、乙酸、1-辛烯-3-醇、长叶烯、香叶基丙酮，这些化合物构成了红曲米特有的风味。通过对比分析可以得出，武宣地区不同乡镇生产的红曲米中风味物质明显不同，这可能与红曲米中微生物种类不同以及地方水质有关。

图3 武宣地区红曲米中挥发性风味化合物热图Fig.3 Heat map of volatile flavor compounds in red yeast rice in Wuxuan region

程伟等[19]利用气相色谱-质谱分析技术(GC-MS)测定一株红曲霉菌种子液的香气物质，研究表明，红曲霉种子液中主要风味的贡献者是醇类物质。其检测出的挥发性物质与本研究一致的有苯乙醇、2-甲基吡嗪、棕榈酸乙酯。红曲米是以白米为原料，由多种红曲霉菌、乳酸菌、醋酸杆菌等微生物发酵而成的传统食品，由近年来学者对普通白米和红曲霉菌株挥发性化合物检测的研究可认为[20-22]，红曲霉在发酵过程中产生了带有花香的醇类物质，具有坚果香、烘烤香的吡嗪类物质及富含果香的酯类物质，这些重要的风味化合物赋予了红曲米独特的风味。

2.2 广西武宣地区红曲米挥发性风味物质主成分分析

主成分分析是一种研究多个变量间相关性的多元统计方法，其原理是将原有变量重新组合，通过较少的几个主成分尽可能多地反映原有多个变量间的相关性[23]。本研究利用R语言对白米及8种红曲米香气成分的含量进行主成分分析，结果见图4。

由图4可知，A村红曲米和B、C、D村红曲米处于不同的象限，说明A村红曲米与其他村落的红曲米在挥发性物质的组成上有较大差异。其中，A村红曲米处于图4(a)的第四象限，主要和第二主成分(PC2)呈负相关，与其相关性较大的主成分有乙酸(C27)、壬酸(C77)、2-正戊基呋喃(C4)、异戊酸(C43)和2,6-二甲氧基苯酚(C75)。

(a)

B、C、D 3个村落的红曲米处于图4(a)的第一象限，与第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)均呈正相关关系。三者彼此间隔距离较小，说明这3种红曲米中挥发性物质的组成差异较小。与这三者相关性较大的主成分包括2,6-二甲基吡嗪(C12)、2-庚酮(C2)、十六烷(C19)、壬醛(C22)、正己醇(C16)、α-松油醇(C45)、4-羟基丁酸乙酰酯(C17)。这4个不同村落生产的红曲米，其挥发性化合物在种类和含量上存在显著差异，这可能是由于所用曲种不同，其内含的微生物种类和数量不同，影响红曲米发酵过程，导致风味上差异显著。后续可以通过对广西红曲米中微生物菌群的鉴定，分析其影响红曲米风味形成过程的机理。同时，筛选出发酵过程中有益的优势菌株，利用纯种混合发酵，提高广西红曲米的发酵特性及品质。

3 结论

采用顶空固相微萃取技术对广西武宣地区不同村落所产8种红曲米的香气成分进行提取，并使用气相色谱-质谱联用技术对其进行分析鉴定，结果表明，8种红曲米中共鉴定出95种挥发性风味物质，其中酯类18种、酮类17种、醇类14种、酸类12种、醛类4种、酚类8种、吡嗪类6种、烷烃类4种、醚类3种、其他化合物9种。均检出的挥发性风味组分是2,6-二甲基吡嗪、十六烷、壬醛、十四烷、乙酸、1-辛烯-3-醇、长叶烯和香叶基丙酮，这些化合物多具有脂香、花香和果香，构成了红曲米独特的主体香气特征。

对8种红曲米的香气成分进行主成分分析，结果表明，A村红曲米与其他村落的红曲米在挥发性物质的组成上有较大差异，而B、C、D 3个村落的红曲米中挥发性物质的组成差异较小。乙酸、壬酸、2-正戊基呋喃、异戊酸和2,6-二甲氧基苯酚对A村红曲米的主体香气有重要贡献；2,6-二甲基吡嗪、2-庚酮、十六烷、壬醛、正己醇、α-松油醇、4-羟基丁酸乙酰酯对B、C、D村红曲米主体香气的贡献较显著。