HBeAg阳性慢性乙型病毒性肝炎患者外周血中分泌IL-21的CD4+ T细胞频数的检测及临床意义

范清琪， 汪 婷， 陈沛冬， 汪月娥

机体感染乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）后，在HBV特异性抗原刺激下，CD4+T细胞在多种细胞因子的作用下分化为辅助性T细胞（Thl、Th2、Thl7）及调节性T细胞（Treg），影响细胞因子之间的网络平衡。白细胞介素21（IL-21）是一个多功能、多效应的细胞因子，在细胞免疫应答中起至关重要的作用，其主要由活化的CD4+T细胞分泌。CD4+T细胞分泌的 IL-21 还可促进CD8+T细胞的分泌，增强 HBV 感染过程中CD8+T细胞应答和杀伤功能，在清除病毒和控制慢性感染中发挥重要作用。CD4+T细胞与细胞因子（如IL-21）间的表达调节失衡与HBV感染后慢性乙型病毒性肝炎（慢乙肝）的发生、发展密切相关[1-2]。本研究检测复旦大学附属华山医院乙肝病毒e抗原（HBeAg）阳性慢乙肝患者外周血单个核细胞中CD4+T淋巴细胞分泌IL-21频数，结合患者的临床资料、乙肝表面抗原（HBsAg）定量及IL-21等指标，辅助判断经核苷（酸）类似物抗病毒治疗的结局。

1 材料与方法

1.1 病例来源

收集自2010年1月—2019年1月在我院肝病门诊就诊的患者67例，所有患者诊断均符合中国《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》，并排除合并有甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎，HIV，肝硬化，肝衰竭和肝癌等的患者。收集67例使用核苷（酸）类似物进行抗病毒治疗的HBeAg阳性慢乙肝患者，抗病毒治疗后，其中出现HBeAg阴转或血清转换慢乙肝患者39例，而治疗至少3年以上仍为HBeAg阳性者28例。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV DNA、HBsAg定量检测 患者血清HBV DNA定量水平采用荧光定量聚合酶链反应法（PCR）检测；HBsAg的检测采用罗氏的Cobas e601全自动电化学发光分析仪，试剂盒由罗氏诊断产品上海有限公司提供，未稀释样本的线性范围是0.05～130 U/mL，进行1∶400稀释后，样本线性范围是20～52 000 U/mL。

1.2.2 IL-21的检测 采用双抗体夹心ELISA，检测仪器为MK3酶标仪（Multiskan MK3，Thermo-Electron Corporation，USA），试剂盒由美国R&D公司提供。血清检测孔中先加样本稀释液40 μL，再加待测血清10 μL，标准品浓度为1 600 ng/L，按 800、 400、200、 100、50 ng/L 浓度对倍稀释，共5孔，每孔加标准品50 μL，同时做空白孔。封板后混匀，室温孵育2 h后洗涤，洗涤5次，每次1 min。除空白孔外各反应孔加入1×Avidin-HRP抗体50 μL，室温孵育45 min，同上洗涤。每孔加入显色底物TMB 100 μL，避光10 min，每孔加入100 μL终止液，30 min内酶标仪在450 nm波长测定光密度D值（参考波长630 nm），通过标准品浓度和其D值拟合线性回归曲线，根据稀释倍数计算血清中IL-21的水平。

1.2.3 流式细胞术检测外周血中分泌IL-21的CD4+T细胞（CD4+IL-21+T细胞）的频数 取患者肝素抗凝全血标本250 μL，用RPMI1640悬浮细胞培养基1∶1等体积稀释到500 μL。再在标本中加入能刺激CD4+T细胞分化的250X PMA/Ionomycin 2 μL和能使细胞因子不能分泌到细胞外的细胞内蛋白分泌抑制剂250XMonensin/BFA 2 μL，混匀后，在 37℃， 5%CO2培养箱培养 4～6 h。取两支流式管，标记为对照组和实验组，分别加入100 μL培养好的全血及流式抗体CD45-KO/CD3-ECD/CD8-PE 各 10 μL。4℃ 避 光 孵 育30 min，加入固定破膜剂A 100 μL，室温避光孵育15 min，加入PBS，500×g离心5 min，弃上清液收集细胞，加入固定破膜剂B 100 μL，涡旋，室温避光孵育15 min。分别在对照组管和实验组管中加入 IgG1-Alexa Fluor®647 和 IL-21-Alexa Fluor®647抗体各20 μL，混匀，室温孵育30 min，加入PBS，500×g离心5 min，弃上清液收集细胞，用0.5 mL PBS重悬后在美国贝克曼Navios流式细胞仪上检测，并绘制出细胞频数图。

1.2.4 统计分析 统计学分析应用Stata13.1统计软件对数据进行统计处理，两组间的计量资料通过均数±标准差（）的方式来表示，组间比较用t检验。计数资料比较用卡方检验。采用logistic回归分析方法分析慢乙肝患者抗病毒治疗结局可能的影响因素。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总体情况及临床资料比较

共67例HBeAg阳性慢乙肝患者入组，其中男42例，女25例。接受核苷（酸）类似物治疗后出现HBeAg阴转或血清转换慢乙肝患者39例，仍为HBeAg阳性者28例。两组患者基线资料见表1。67例患者中接受拉米夫定6例、阿德福韦酯7例、恩替卡韦34例、替诺福韦7例、替比夫定5例、拉米夫定联合阿德福韦酯8例。两组患者的临床资料经分析可见，HBeAg阴转或血清转换组和HBeAg持续阳性组的年龄（P=0. 963）、基线时的ALT（P=0.071）、HBV DNA（P=0.716）以及用药疗程（P=0.589）之间的差异无统计学意义。

2.2 外周血IL-21、HBsAg定量以及CD4+IL-21+T细胞频数的比较

HBeAg阴转或血清转换组的IL-21较HBeAg持续阳性组高而HBsAg定量则较低，且差异均有统计学意义，P值分别为0.004、0.028。见表1。HBeAg阴转或血清转换组中CD4+IL-21+T细胞频数为（1.22±0.36）%，HBeAg持续阳性组中为（0.89±0.25）%，两组差异有统计学意义（P＜0.001）。图1为HBeAg持续阳性组患者的CD4+IL-21+T细胞频数图，图2为HBeAg阴转或血清转换组慢乙肝患者的CD4+IL-21+T细胞频数图。

图1 HBeAg持续阳性组患者的CD4+IL-21+T细胞频数Figure 1 Frequency of CD4+IL-21+ T cells in patients with persistent positive HBeAg

图2 HBeAg阴转或血清转换组慢乙肝患者的CD4+IL-21 +T细胞频数Figure 2 Frequency of CD4+IL-21+ T cells in chronic hepatitis B patients with HBeAg negative or serum conversion

表1 67例HBeAg阳性慢乙肝患者的临床资料比较Table 1 Clinical characteristics of chronic hepatitis B patients in terms of HBeAg status

2.3 HBeAg阳性慢乙肝患者抗病毒治疗结局的相关因素分析

采用logistic回归分析，探讨疗程、基线HBV-DNA水平、ALT水平、IL-21浓度、HBsAg水平、CD4+IL-21+T细胞频数与抗病毒治疗后HBeAg阴转或血清转换的关系。单因素分析显示， CD4+IL-21+T细胞频数（OR=28.656，95%CI2.929～280.394，P=0.004）、HBsAg水平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999；P=0.023）和 IL-21（OR=1.002，95%CI1.001～1.004；P=0.007）与抗病毒治疗后HBeAg阴转或血清转换有关。见表2。多因素分析则提示CD4+IL-21+T细胞频数（OR=36.118，95%CI4.744～274.982，P=0.001）、HBsAg 水 平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999，P=0.026）与抗病毒治疗后HBeAg阴转或血清转换有关。见表3。

表2 HBeAg阳性慢乙肝患者经核苷类似物治疗后出现应答的相关变量单因素分析Table 2 Univariate analysis of the variables associated with complete response to anti-HBV nucleosides analogs therapy among HBeAg-positive chronic hepatitis B patients

表3 HBeAg阳性慢乙肝患者经核苷类似物治疗后出现应答的相关变量多因素分析Table 3 Multivariate analysis of the variables associated with complete response to anti-HBV nucleosides analogs therapy among HBeAg-positive chronic hepatitis B patients

3 讨论

世界卫生组织报道，全球慢性HBV感染者约有2.57亿[3]。在我国，一般人群中HBsAg流行率为5%～6%，其中慢乙肝患者有2 000万～3 000万例[4]。慢乙肝患者中，在病毒的特异性抗原刺激下，淋巴细胞亚群功能产生失衡、紊乱，并造成特异性T细胞和B细胞的应答反应显著降低、功能耗竭[5-7]。而高水平的HBeAg也会引起T细胞亚群失衡，与肝损伤及HBV并发症的发生有关[8]。HBeAg血清学转换对HBV介导的免疫调控起到一定的改善作用，并可能进一步阻止患者进展为终末期肝病，是目前临床上的重要治疗目标。因此，本研究的目的是确定HBeAg阳性慢乙肝患者抗病毒治疗发生HBeAg阴转或血清转换的预测因素。

本研究结果显示，在多因素分析中HBsAg水平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999，P=0.023）与抗病毒治疗后HBeAg阴转或血清转换有关，这与Shen等[9]研究结果相似。目前HBsAg的水平还用于预测慢乙肝患者停用核苷（酸）类似物治疗后复发可能的研究[10]。

IL-21现已被广泛应用于预测HBeAg阳性的慢乙肝患者发生HBeAg消失或者血清转换[11]。IL-21及其下游效应细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）能够有效抑制HBV复制，促进HBV感染患者抗病毒治疗的结局与转归[12]。Ma等[13]研究发现，IL-2l水平的升高与慢乙肝抗病毒的治疗应答有关。治疗12周时的IL-2l水平与HBeAg血清转换相关，并可进一步预测治疗1年后HBeAg阴转或者血清转换。本研究显示，HBeAg阴转或血清转换组中IL-21水平虽高于HBeAg持续阳性组，P值为0.004，但在多因素分析中，两组差异却无统计学意义。虽然这种差异可能是由于目前研究的样本量小造成，但是也有可能与IL-21的基线水平无法有效评估HBeAg阳性慢乙肝患者抗病毒的结局有关。随着抗病毒治疗疗程的进展，IL-21水平的变化是否会与HBeAg的清除存在一定的相关性，我们将在后续的研究中进一步探究。

T细胞膜表面有100多种特异性抗原，1986 年，WHO将这100多种特异性抗原统称为白细胞分化抗原（cluster differentiation，CD）。CD4+IL-21+T细胞是IL-21的主要来源。有研究显示，HBeAg阳性慢乙肝患者的CD4+IL-21+T细胞频数相较于健康人群明显升高[14]。而表达趋化因子受体5型的CD4+T细胞（CXCR5+CD4+T细胞）可诱导机体B细胞进一步产生HBeAb，有利于HBeAg的消失或血清学转换，提示可能与HBeAg阳性慢乙肝患者的优化治疗相关。Cooksley等[15]研究显示，HBeAg阳性慢乙肝患者经过阿德福韦酯治疗后，HBeAg消失或血清转化可能与 CD4+T细胞对HBV免疫应答增强相关。本研究发现，HBeAg阴转或血清转换组CD4+IL-21+T细胞频数明显高于HBeAg持续阳性组（P＜0.001）。多因素分析结果更提示，CD4+IL-21+T细胞频数可用于预测HBeAg阳性慢乙肝患者抗病毒治疗结局。

本研究存在一定的局限性，收集的患者例数相对较少、随访时间短、选择用于统计的可能影响因子有一定的片面性等问题，但从现有的研究结果来看，CD4+IL-21+T细胞频数和HBsAg定量可用于慢乙肝患者抗病毒治疗结局的预测，可在临床实践中进一步完善。