宁夏地区艰难梭菌感染分子流行病学特征

刘俊枫， 伏 慧， 刘 翔， 王 文， 马 红， 臧一铭， 贾 伟， 李 刚

艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种主要通过粪-口途径传播的专性厌氧的粗大革兰阳性芽孢杆菌，是院内导致胃肠炎相关感染的重要原因[1]。临床艰难梭菌感染主要引起患者腹泻不适，严重者可导致伪膜性肠炎、中毒性巨结肠、肠坏死，甚至危及生命[2]。本研究旨在了解宁夏医科大学总医院住院腹泻患者艰难梭菌感染情况，同时对分离菌株进行毒素基因检测及多位点序列分型（MLST），探讨本地区菌株流行病学特点，为艰难梭菌监测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本收集 收集 2019年1月1日—2020年12月1日此院住院患者腹泻粪便标本。纳入标准：根据2017年美国传染病学会和美国医疗保健流行病学学会颁布的成人和儿童艰难梭菌感染临床实践指南[3]，24 h内出现过≥3次包括稀便、糊状便或水样便患者。排除标准：使用导泄剂或灌肠的患者。本研究已通过医院伦理委员会审批（伦理审批号 ：2020-864）。

1.1.2 主要仪器与试剂 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）、厌氧产气袋（法国生物梅里埃公司），Bugbox厌氧培养箱（英国Ruskinn 公司），艰难梭菌选择性培养基、哥伦比亚血琼脂平板（英国OXOID公司），Premix Taq酶（中国天根有限公司），引物合成及PCR产物测序由上海生工有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 艰难梭菌厌氧培养及鉴定 将患者约0.5 g粪便标本与95%乙醇等体积混匀，室温放置30 min后，6 000 r/min离心5 min，取沉渣接种于艰难梭菌选择性培养基，置于35℃厌氧培养箱中，培养48 h，挑取黄色、扁平、边缘不规则、具有特殊臭味的典型菌落，进行质谱仪鉴定到种。使用艰难梭菌ATCC 9689为选择性培养基的质控菌株、铜绿假单胞菌ATCC 27853为厌氧培养箱中厌氧环境的质控菌株。

1.2.2 DNA提取及毒素基因检测 将鉴定的艰难梭菌纯分转种至血平板培养后，刮取约两环纯菌落，混匀于约150 mL双蒸水的1.5 mL EP管中，100 ℃金属浴加热15 min，12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液为DNA模板－20℃保存。参照Griffiths等[4]方案，扩增毒素基因tcd A和tcd B。参照Gonçalves等[5]方案检测二元毒素基因（ctdA和ctdB），引物序列见表1。反应体系共20 μL：Premix Taq 酶 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL， DNA 模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶80V恒定电压电泳40 min成像观察。

1.2.3 MLST 参照Griffiths等[4]方案，扩增 7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi），引物序列见表1。反应体系共50 μL：Premix Taq 酶 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 22 μL。PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶80V恒定电压电泳40 min成像观察，有明亮目标条带者，将产物送至上海生工有限公司测序，将序列输入网站（https：//pubmlst.org/organisms/clostridioides-difficile）， 获 取 相 应ST型。分型结果聚类分析采用软件BioNum-erics BN7.5cn，相似系数采用Pearson correlation算法，聚类算法选择非加权组平均法（UPGMA）。

表1 艰难梭菌毒素基因及MLST分型相关引物Table 1 Primers used for toxin genes and multi-locus sequence typing of Clostridium difficle

1.2.4 统计分析 采用SPSS 26.0软件对所有数据进行统计学分析。计量资料比较符合正态分布的采用独立样本t检验，非正态分布采用Mann whitneyU检验，计数资料比较采用卡方检验或者Fisher确切检验法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 产毒株筛查

530 份患者腹泻粪便中共检出艰难梭菌38株（7.2%，38/530），其中产毒型艰难梭菌 36 株（6.8%，36/530），其中tcdA（－）tcdB（+） 菌株5株（13.9%，5/36），tcdA（+）tcdB（+）菌株29株（80.6%，29/36），tcdA（+）tcdB（－）菌株2株（5.5%，2/36）。所有菌株均未检出二元毒素cdtA、cdtB。

2.2 临床基本情况

36例艰难梭菌毒素基因阳性患者中男24例，女12 例，平均年龄（51.1±13.5）岁，≥60岁 9例（25.0%）；492例非艰难梭菌感染患者，男235例，女257例，平均年龄（53.4±16.6）岁，≥60岁132例（26.8%）。两组患者比较，性别构成比差异有统计学意义（P=0.037），男性较女性更易发生艰难梭菌感染。两组总体年龄和≥60岁病例数占比差异无统计学意义（P＞0.05）。科室分布中，艰难梭菌感染阳性率以ICU、肾脏内科、血液内科较高。见表2。

表2 艰难梭菌感染组与非感染组基本情况比较Table 2 Baseline data of patients in terms of Clostridium difficile infection

2.3 MLST

对38株艰难梭菌经MLST分型， 部分管家基因电泳图见图1。共有18种ST型：分别为ST2（4株）、ST42（4株）、ST54（4株）、ST3（3株）、ST8（3株）、ST35（3株）和ST102（3株），其余为 ST11（2 株）、ST33（2 株）、ST512（2 株）、ST36（1株）、ST39（1株）、ST99（1株）、ST201（1株 ）、ST221（1株 ）、ST323（1株 ）、ST357（1株）和ST415（1株）。艰难梭菌的ST型别比较分散，未见某一型别在单一科室呈优势型存在；主要为clade1群（32株，84.2%），另外有少量clade3、clade4和clade5群，见图 2。

图1 2株艰难梭菌毒素基因、管家基因电泳图Figure 1 Electrophoretic map of toxin genes and housekeeping genes of two strains of Clostridium difficile

图2 38株艰难梭菌的进化树分析Figure 2 Phylogenetic tree analysis of 38 Clostridium difficile strains

3 讨论

据报道，临床上约 50%～75% 的抗菌药物相关性结肠炎和95%～100% 的伪膜性肠炎是由艰难梭菌感染引起[6]。在一些欧美国家，发生艰难梭菌高产毒株核糖体分型（ribotyping，RT）RT027型、RT078型多次暴发流行[7]，在美国艰难梭菌感染发病率已高于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）引起的感染，成为医院感染的首要病因[8]。本研究中，在腹泻患者中艰难梭菌的分离率为7.2%（38/530），产毒型艰难梭菌分离率为6.8%（36/530），高于2012年宁夏某医院通过酶联免疫分析（ELISA）检测艰难梭菌毒素阳性率3.8%（9/223）[9]，有研究表明艰难梭菌厌氧培养方法灵敏度要高于ELISA，究竟本地区艰难梭菌阳性率是否真实升高[10]，有待进一步研究证实。另外，有研究显示甘肃[11]、内蒙[12]等医院艰难梭菌产毒株阳性率为 9.9%（16/161）和 11.9%（30/252），初步显示西北地区艰难梭菌产毒株阳性率相较华东（37.5%，90/240；16.1%，33/205）[13-14]、华北（34.6%，45/130）[15]地区要低，可能与抗菌药物使用情况有关，而有些研究侧重调查肿瘤患者或ICU致使艰难梭菌感染率偏高，有研究显示，抗菌药物的使用、肿瘤等基础疾病是艰难梭菌感染的危险因素[16-17]。不过这只是散在医院流行病学数据调查，真实情况需要更大范围、多中心研究。

艰难梭菌主要通过分泌毒素A、B及二元毒素而引起肠道感染，毒素A、B分别由位于致病性决定区（pathogenicity locus，PaLoc）的tcdA、tcdB编码，二元毒素由独立于PaLoc之外的染色体基因（cdtA、cdtB）编码，被命名为CdtLoc[18-19]。本研究中，产毒类型以tcdA（+）tcdB（+）cdtA（－）cdtB（－）为主（80.5%，29/36），与相关研究[20-21]较为一致，国外流行的菌株绝大多数也均产生A、B毒素[22]。研究发现在富营养培养基中生长的艰难梭菌通常在平台期表达A、B毒素，而毒素的表达受多种环境的影响，包括温度、某些抗生素的浓度、群体信号等[23]。本研究中所有菌株虽未检出二元素基因cdtA、cdtB，但国内已有少数RT027型[24]、RT078型[25]以及其他型别[26]菌株基因检测阳性的报道，它们产生的二元毒素致病力更强，防止其在国内播散流行的问题不容忽视[27]。

艰难梭菌分子分型方法很多，欧洲主要使用RT分型，北美主要使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型，这使得不同型别之间的交流比较困难，MLST是一种可靠准确的基于7个管家基因测序的分型方法，国内常使用此种方法，更利于实验室之间数据共享交流。本研究中，艰难梭菌被分成18种ST型，主要的ST型为ST2、ST42和ST54，这与国内Wang等[28]研究中发现以ST54、ST2和ST37型为主的结果较为相似。有研究显示中国华北地区ST54是优势型别[29]，华东地区ST37是优势型别[21]，亚洲其他国家报道也流行ST37型[30]，不同的是本研究中未见ST37型。欧美国家主要流行RT027型， RT型与ST型并非一一对应，但有研究表明RT027型与ST1型密切相关[31]，本研究未发现ST1型。遗憾的是本研究未进行RT、PFGE分型，筛查人群仍很有限，需要未来进一步的工作。

总之，本研究阐述了艰难梭菌在宁夏地区一所大型教学医院的毒力基因及MLST型别，丰富了全国艰难梭菌监测流行病学数据。本地区尚未发现艰难梭菌暴发流行，随着危险因素如过度使用抗生素、住院老年人口不断增长等，意味着艰难梭菌感染可能会成为一个严重的问题。因此，临床应加强对艰难梭菌的监测及流行病学分析和研究， 以预防艰难梭菌在医院内感染及流行。