血管性痴呆小鼠空间工作记忆障碍的机制探讨

杨惠云，刘迢迢，齐成玺，田 心，张荣信

1 天津医科大学 生物医学工程与技术学院，天津 300070；2 广东药科大学 生命科学与生物制药学院，广东广州 510006

血管性痴呆 (vascular dementia，VaD)是常见的痴呆原因之一，约15%的痴呆病例由血管性痴呆引起，主要表现为认知功能障碍，包括学习、记忆、思维功能的降低等[1]。工作记忆是人类认知的核心部分，空间工作记忆可对空间信息进行暂时保存和控制，是一个动态编码的过程[2-3]。海马是空间工作记忆的重要脑区，是大脑重要的信息处理部位[4-5]。N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)是一种离子型谷氨酸受体，对学习、记忆的形成和维持以及神经元突触可塑性至关重要[6-8]。NMDAR2A 基因是功能性NMDAR 离子通道最主要的组成部分。NMDAR2A 基因敲除的小鼠不但表现出海马突触可塑性的减退，而且在水迷宫实验中表现出学习记忆能力的下降[9]。本实验通过建立VaD 小鼠模型，应用Longa 评分法和平衡木行走实验对小鼠进行神经性评分，通过T 迷宫对小鼠的工作记忆行为学进行分析，氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法评价VaD小鼠的脑梗死体积，应用蛋白免疫印迹法对小鼠海马蛋白NMDAR2A 表达量进行检测，以探讨VaD 小鼠空间工作记忆障碍的发病机制。

材料和方法

1 实验动物健康的清洁级雄性ICR 小鼠16 只，2 月龄，分笼饲养于天津医科大学实验动物中心。动物在明/暗周期为12 h/12 h、室温(23 ±2)℃、湿度55% ± 5%的安静舒适条件下适应饲养3 d，食物和水随机获取。所有动物实验均经天津医科大学动物伦理委员会批准，符合实验动物的伦理规范。上述小鼠随机分为对照组(8 只)和VaD 组(8 只)。

2 主要仪器与试剂电子天平(瑞 士Mettler Toledo 公司)；纯水仪(德国Millipore 公司)；冷光源(中国上海精密仪器有限公司)；小动物麻醉机(中国深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；体视显微镜(中国深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；小鼠脑立体定位仪(中国深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；蛋白质电泳仪(美国Bio-Rad 公司)；蛋白质印 迹转膜仪(美国Bio-Rad 公司)；TTC(美国Sigma 公司)；异氟烷（中国深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；小鼠抗-NMDAR2A 抗体(美国Santa Cruz 公司)；小鼠抗β-actin 抗体(美国Santa Cruz 公司)。

3 动物VaD 模型的制备 小鼠于手术前8～12 h禁食，不禁水。5%异氟烷对小鼠进行诱导麻醉，2.5%异氟烷维持小鼠的麻醉状态。将小鼠仰卧固定，分离左侧颈总动脉，并用动脉夹夹闭20 min后再灌注10 min，重复2 次。伤口用庆大霉素处理防止感染，缝合皮肤。术中注意防止过分牵拉刺激或损伤迷走神经。采用同样方法分离对照组小鼠左侧颈总动脉，但不对其进行血管夹闭。两组小鼠术后常规饲养[10]。

4 神经功能评价VaD模型制备后，采用Longa 评分法和平衡木行走实验方法对小鼠的神经功能进行评价[11-12]。1)Longa 评分法：评分标准：正常，记0 分；小鼠出现轻度转圈并伴随非持续性翻转，提尾时 <50%的可能性试图转至对侧，记1 分；中度持续转圈，提尾时 >50%的可能性试图转至对侧，记2 分；持续强烈转圈，提尾并保持旋转姿势，记3 分；自发性严重翻转，失去行走能力，记4 分；昏迷或垂死，记5 分。分数越高，表明小鼠的神经功能缺损越严重。2)平衡木行走实验：取直径12 mm，长约60 cm 的圆柱状平衡木，放置离地面约1 m 高度，平衡木一端放置一黑箱子，记录小鼠滑落平衡木的时间。在正式实验前，给予每只小鼠30 s 的适应时间。每只小鼠测试3 次，测试间隔时间为5 min。

5 T 迷宫行为学测试 小鼠造模后进行T 迷宫行为学工作记忆实验。T 迷宫由1 条起始臂和2 条目标臂拼接组成，目标臂呈对称。小鼠从起始点出发，交替选择目标臂。在臂的末端放置食物诱导小鼠做出选择，在起始臂的起始点处有一个可移动闸门。T 迷宫工作记忆范式由3 个相位构成(图1)：打开闸门，小鼠从起始点出发，进入T 迷宫的主干臂，随机选择一个目标臂并得到食物奖励，将此次选择记为起始选择；小鼠得到奖励后回到起始点，关闭闸门，延时5 s；打开闸门，小鼠再次选择目标臂，若选择与前一次相同的目标臂记为行为学错误，若选择与上一次相反的目标臂记为行为学正确。每只小鼠每天训练1 次，每次训练正确选择次数10 次以上。连续3 d 小鼠选择正确率达到80%以上，则代表小鼠形成工作记忆，可停止实验。

图1 T 迷宫空间工作记忆范式[13]Fig.1 Schematic of spatial working memory in T-maze task

6 TTC 染色计算小鼠脑梗死体积 应用TTC 染色法对小鼠脑组织缺血范围进行测量。小鼠T 迷宫行为学测试后，各组随机取其中3 只麻醉并断颈取脑（除去嗅球），于-20℃冰箱中速冻。20 min后取出行冠状面切片，平均切成5～6 片，厚度约2 mm。随后将切片浸没于2%的TTC 溶液中，于37℃温箱避光孵育20 min。染色过程中视脑片染色情况进行缓慢翻转，以使脑片进行充分染色。正常脑组织染成红色，缺血或梗死组织则不染色(呈白色)。染色后使用1 × PBS 洗去多余的TTC 溶液，再用4%多聚甲醛固定。采用Image Pro Plus 6.0 测量脑梗死面积和全脑面积，计算脑梗死区域所占百分比 (脑缺血或梗死面积/全脑面积 × 100%)。

7 蛋白质免疫印迹法检测海马NMDAR2A 蛋白的表达 小鼠T 迷宫行为学测试后，取患侧海马置于-80℃冰箱保存。需要时取出，进行组织裂解、研磨、超声破碎，加入蛋白酶抑制剂，冰上孵育20 min。4℃ 16 000 r/min 离心15 min，取上清，BCA 法测定蛋白浓度。电泳100 V、2.5 h，转膜400 mA、2 h，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，孵育一抗 (1∶500) 4℃过夜。第2 天，TBST 缓冲液洗涤3 次 × 10 min，孵育二抗(IgG 1∶5 000) 2 h，TBST 缓冲液洗涤3 次 × 10 min，ECL 发光液显影并采集蛋白条带，通过Image J 软件处理分析统计。

8 统计学分析 使用SPSS18.0 软件对数据进行分析。对两组小鼠在T 迷宫的工作记忆行为学正确率及任务完成时间进行重复测量双因素方差分析，然后进行Bonferroni post hoc 检验。计量数据以表示，两组间行独立样本t检验进行分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 两组小鼠神经功能评价 VaD 小鼠模型制备后，对小鼠的神经功能进行评价。采用Longa 评分法，对照组小鼠无神经功能损伤症状，VaD 组小鼠的神经功能明显受损(P<0.05)。平衡木行走实验中，与对照组相比，VaD 组小鼠滑落平衡木的时间明显缩短(P<0.05)。见图2。

图2 两组小鼠的神经功能评价(A：Longa 评分法对两组小鼠的神经功能评价；B：平衡木实验对两组小鼠的神经功能评价)Fig.2 Comparison of neurological score between the two groups(A:Evaluation of neurological score by Longa method;B:Evaluation of neurological score by balance beam test)

2 两组小鼠工作记忆行为学正确率比较 两组小鼠经过10 d 的工作记忆行为学训练后，对照组小鼠的行为学正确率从训练第1 天的64.81% ±8.02%逐步增加到第10 天的87.3% ± 2.68%，连续3 d 的工作记忆行为学正确率均达到80%以上，说明对照组小鼠经过10 d 的工作记忆任务训练，形成了工作记忆。VaD 组小鼠在工作记忆训练的10 d 内，训练的正确率均没有超过60%。重复测量双因素方差分析显示，组别因素 × 训练天数交互效应无统计学差异(P>0.05)，但两组间的行为学正确率有统计学差异(P<0.05)，同时两组小鼠在不同时间点的行为正确率也有统计学差异(P<0.05)。进一步对两组小鼠在第10 天的工作记忆行为学正确率进行比较，经Bonferroni post hoc 检验，VaD 组小鼠与对照组相比，行为学正确率显著降低(P<0.05)，表明VaD 组小鼠的空间工作记忆能力受到损坏。见图3。

图3 两组小鼠工作记忆行为学正确率统计比较(A)及第10 天正确率比较(B)Fig.3 Comparison of accuracy of working memory behavior (A),and accuracy at the 10th day (B) between the two groups

3 两组小鼠工作记忆任务完成时间比较 对照组小鼠的工作记忆完成时间由第1 天的 (15.49 ±4.36) s 减少到第10 天的(1.66 ± 0.43) s；VaD 组小鼠在T 迷宫工作记忆的完成时间由第1 天的(24.82 ± 4.12) s 减少到第10 天的(7.28 ± 1.27) s，重复测量双因素方差分析显示，组别因素 × 训练天数交互效应无统计学差异(P>0.05)，但两组的完成时间有显著性差异(P<0.05)。同时两组小鼠在不同时间的工作记忆任务完成时间也有显著性差异(P<0.05)。对两组小鼠第10 天的工作记忆任务完成时间进行Bonferroni post hoc检验发现，VaD 组小鼠与对照组相比，完成时间显著延长(P<0.05)，表明VaD 组小鼠的空间工作记忆能力受到损坏。见图4。

4 两组小鼠脑梗死体积比较 经TTC 染色后，VaD 组小鼠脑梗死组织呈现白色(图5A)。与对照组小鼠相比，VaD 组小鼠的脑梗死体积显著增加(P<0.05)(图5B)。

5 两组小鼠海马NMDAR2A 蛋白表达量比较免疫印迹分析显示，与对照组相比，VaD 组小鼠海马NMDAR2A 蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图6。

图6 两组小鼠海马NMDAR2A 表达量的比较(A：Western blotting结果；B：定量分析结果)Fig.6 Comparison of expression of hippocampal NMDAR2A between the two groups (A:Western blotting results;B:Quantitative analysis result)

讨论

本研究对VaD 小鼠空间工作记忆障碍的发病机制进行了探讨，发现与对照组相比，VaD 组小鼠的神经功能明显受损(图2)，工作记忆行为学正确率显著降低(图3)，工作记忆任务的完成时间显著延长(图4)，脑梗死体积显著增加，海马NMDAR2A 蛋白表达水平显著降低(图5)。

图4 两组小鼠工作记忆行为学时间-训练天数比较(A)及第10 天完成时间比较(B)Fig.4 Comparison of completion time of working memory behavior(A) and completion time at the 10th day (B) between the two groups

图5 TTC 染色后脑梗死区域代表图(A)及两组小鼠脑梗死体积比较(B)Fig.5 Representative pictures of TTC stained brain portions for cerebral infarction (A) and comparision of cerebral infarct volume between two groups of mice (B)

VaD 被认为是由脑血流量减少引起的进行性疾病，是继阿尔茨海默病之后最常见的痴呆原因之一，并且随着人口老龄化而增加，越来越多的老年人患有VaD。VaD 的风险涉及许多危险因素，包括高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、心房颤动和高同型半胱氨酸血症[14-16]。研究VaD 的记忆障碍机制，具有重要的社会效益和医学应用价值。

缺血所致的VaD 会影响认知能力，尤其是执行能力[17]。VaD 小鼠在八臂迷宫和T 迷宫实验中有更高的错误率，同时在水迷宫实验中逃避潜伏期更长[18-20]。本研究通过T 迷宫行为学测试发现，对照组小鼠连续3 d 的行为学正确率达到80%以上，形成了工作记忆；而VaD 组小鼠经过训练没有形成工作记忆。同时对照组小鼠在T 迷宫中工作记忆行为学任务完成时间显著短于VaD 组小鼠，表明应用颈总动脉结扎再灌注方法能成功制备VaD 小鼠模型，并使其工作记忆能力和执行能力遭到损坏。这可能是由于脑缺血后脑组织发生Ca2+内流紊乱，大量Ca2+蓄积在神经细胞内产生严重的毒性作用，并导致神经细胞死亡，从而影响工作记忆能力和执行能力。

海马在人类高级认知活动中担认存储信息及学习记忆的重要作用。脑组织缺血缺氧后，神经元突触结构会发生破坏，进而导致突触功能障碍，学习记忆功能及认知功能下降。Yang 等[21]对VaD 大鼠海马超微结构进行观察发现，海马突触结构损坏，突触囊泡数量降低，突触后膜增厚且突触间隙消失，同时海马CA3-CA1 突触的长时程增强 (long-term potentiation，LTP)降低。NMDAR 是一种兴奋型氨基酸特异性受体，在大脑信号传导和发育中起着至关重要的作用，在海马神经元可塑性中发挥重要作用，并参与LTP 的形成。NMDAR2A 和NMDAR2B 是NMDAR 重要的调节亚基，在学习记忆中起重要作用[22]。人巨噬细胞病毒感染大鼠后，海马NMDAR2A 表达降低[23]。NMDAR2A 和NMDAR2B 基因敲除后，小鼠海马突触可塑性降低，学习记忆能力下降，海马兴奋性突触后电位消失，移植转染NMDAR2B基因细胞可使大鼠记忆明显增高[8]。Zhang 等[24]发现大鼠缺血再灌注后NMDAR2A 表达量降低。本研究通过免疫印迹分析方法发现，VaD 组小鼠海马区NMDAR2A 蛋白表达量明显低于对照组，提示NMDAR2A 表达量下降在VaD 小鼠空间工作记忆受损中具有不可或缺的作用。

VaD 所致的记忆障碍是一个极其复杂的病理过程，包括氧化应激、神经炎症、神经递质系统功能障碍、线粒体功能障碍和生长因子改变等[25-26]。尽管近些年取得了很大进展，但仍有一些争议有待解决，今后应对VaD 记忆功能障碍的发病机制进行更深入的研究。