不同TNM分期膀胱癌患者外周血CTCs的表达及临床意义

毛天赐，张伟，罗娟

1.空军军医大学唐都医院泌尿外科，陕西 西安 710038；2.西安市儿童医院耳鼻喉科，陕西 西安 710038

当膀胱细胞丧失控制时就会形成膀胱癌，该病为泌尿科常见的恶性肿瘤，具有较高的患病率，居恶性肿瘤第9 位[1]。早期多数患者常出现肉眼可见的血尿，随着病情的不断发展，还会出现尿急、尿频、尿痛等临床症状[2]。该病具有复发性高、致死率高及恶化程度较高等特点，造成该病患者死亡的主要因素为癌转移，早期淋巴结转移较多，依据肿瘤分级，进行膀胱根治切除术后淋巴结阳性率为5%～10%[3-4]。早期膀胱癌5 年内的生存率约69%，患者一旦出现周围淋巴结被入侵，5 年生存率随之下降为35%，若发生远处转移，5 年内生存率可下降至5%，因此早期诊断并予以及时的治疗是改善患者预后的重点所在[5-6]。循环肿瘤细胞(CTC)为入侵外周血的细胞，同时也是肿瘤发生远处转移的基本条件，因此检测CTC 可为判断患者是否出现远处转移、治疗方案的选择提供重要依据[7]。本文分析了不同肿瘤分期(TNM)膀胱癌患者外周血CTCs 的表达情况，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取空军军医大学唐都医院2018 年6 月至2020 年9 月接收的58 例膀胱癌患者作为研究对象。纳入标准：(1)所有患者自主同意参与本研究；(2)患者均符合膀胱癌的诊断标准[8]；(3)抽血检查前未接受化疗、放疗等治疗措施；(4)依从性良好者。排除标准：(1)临床资料缺失或不全者；(2)合并其他恶性肿瘤者；(3)肝肾功能障碍者；(4)尿路感染者。58 例中男性35 例，女性23 例；年龄43～72 岁，平均(63.54±4.67)岁，其中≤63 岁27 例，＞63 岁31 例。依据国际TNM 分期系统将患者进行划分，T 分期：T1期13 例，T2期16 例，T3期19 例，T4期10 例；N 分期：N0期26 例，N1期17 例，N2期8 例，N3期7 例；M 分期：M0期48 例，M1期10 例；TNM 总分期包括Ⅰ期10 例，Ⅱ期16 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期14 例；分化程度较低者35 例，分化程度较高者23 例；出现脉管侵犯者41 例，未出现脉管侵犯者17 例；出现神经侵犯者38 例，未出现神经侵犯者20 例；肿瘤大小≤6 cm3者34 例，肿瘤大小＞6 cm3者24例。

1.2 方法

1.2.1 CTCs采集方法 采集患者外周血5～8 mL，弃去前2 mL血液(前2 mL血液可能混合上皮细胞，导致结果出现假阳性)，收集于ACD抗凝管内，将其上下轻微颠倒以混匀血液，血液标本的保存及运输均置于0℃～4℃环境中。

1.2.2 血液样品CTCs的染色及分离 (1)选用密度梯度离心法进行样本处理。采用磷酸缓冲盐溶液(PBS)依照1∶1 的比例进行全血稀释，将稀释所得血液样本缓慢置入含有20 mL 聚蔗糖(Ficoll)单核层细胞分离液的离心管中(刻度为50 mL)进行离心，时间约15 min。离心处理后弃去上层血浆，将所留样品置入新离心管(刻度为50 mL)中，向离心管内添加PBS约20 mL，轻微摇晃混匀，4℃环境中进行离心，时间为10 min，离心后弃去上清液。(2)捕获抗体(EpCAM)的孵育。将200 μL的PBS重悬细胞转移至离心管中(刻度为1.5 mL)。添加1份EpCAM，在正常室温环境中进行孵育，时间为1 h。孵育后再次加入800 μL的PBS进行混匀，离心5 min，弃去上清液，应用200 μL 的PBS 重悬细胞。(3)肿瘤细胞的分离。将孵育得到的细胞悬液置入芯片中予以细胞分离，流速以200 μL/h 为宜，时间为1 h，分离后拆开芯片，并将芯片放置于器皿内。(4)CTCs 的染色方法。在芯片表面铺满固定剂，并进行15 min 的处理后除去固定剂。加透膜剂，予以处理，时间为15 min。加一抗混合液，在4℃避光环境中进行过夜孵育。次日应用PBS 进行泡洗，在15 min内、7～8 mL 的PBS 里进行3 次。再加二抗混合液，室温条件下进行避光孵育，约40 min，加染核试剂，时间为20 min。再次应用PBS 进行泡洗，方法与上述一致。观察并计算CTC阳性细胞数。见图1和图2。

图1 可疑肿瘤细胞(×200)

图2 上皮来源细胞(×200)

1.3 观察指标 (1)比较不同临床病理特征(包括性别、病理类型、年龄、分化程度、肿瘤大小、TNM总分期、T分期、N分期、M分期、脉管侵犯及神经侵犯等)患者之间CTCs 阳性率的差异。(2)比较不同TNM 分期患者的CTCs计数。

1.4 统计学方法 应用SPSS22.0 统计学软件分析数据。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两两比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同临床病理特征患者的CTCs 阳性率比较 58 例患者中CTCs 阳性者共22 例。膀胱癌患者不同性别、病理类型、年龄、分化程度及肿瘤大小间的CTCs 阳性率比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)；TNM 总分期(Ⅲ期+Ⅳ期)、T3+T4、N1+N2+N3、M1、脉管侵犯及神经侵犯患者中的CTCs 阳性率明显高于Ⅰ期+Ⅱ期、T1+T2、N0、M0及无脉管侵犯和神经侵犯者，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 不同临床病理特征患者的CTCs阳性率比较[例(%)]

2.2 不同TNM分期患者CTCs计数比较 CTCs计数在Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者中依次升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 不同TNM分期患者的CTCs计数比较(，个)

表2 不同TNM分期患者的CTCs计数比较(，个)

注：与Ⅰ期比较，aP＜0.05；与Ⅱ期比较，bP＜0.05；与Ⅲ期比较，cP＜0.05。

3 讨论

膀胱癌为泌尿系三大恶性肿瘤之一，发病率及致死率均居泌尿系恶性肿瘤前列，该病患病率存在种族性、地域性、性别差异，可于任何年龄患病，好发于50～70 岁人群[9-10]。相关调查结果显示，2018 年世界范围内膀胱癌患者约为54.9 万人，死亡人数约20 万人[11]。多数患者通常表现为肉眼无痛性血尿，随着肿瘤的持续性生长及不断浸润，可导致间断性血尿发展为持续恶性血尿，患者于晚期可发生排尿不畅等情况，甚至出现上尿路梗阻及尿潴留情况[12]。该病发病因素较复杂，临床难以确定具体的患病病因，其中基因因素与环境因素具有较为密切的联系，基因因素包括癌基因激活因素，环境因素主要包括吸烟、慢性长期性炎症、高危型化学物品等[13]。随着医疗技术的不断发展，发现膀胱癌与其他因素也存在密切的关系。

国内外对于外周血CTCs 在恶性肿瘤(如前列腺癌、乳腺癌、肺癌等)中的研究及报道较多，目前有多项研究表明，肿瘤TNM分期情况CTCs之间有一定的相关性，有利于制定个性化治疗方案及后期疗效观察，现普遍认为该病发生的前提之一为CTCs。孙建兵等[14]提出过关于肾癌的研究，该研究将99 例肾癌患者，依据性别、病灶部分、浸润深度、年龄、分化程度、TNM分期及脉管癌栓进行划分，探讨与CTCs 之间的关系。有研究表明，TNM 分期与CTCs 之间具有较高的相关性。检测膀胱癌患者外周血CTCs水平能有效判定患者血行转移情况以及远处转移情况[15]，对患者预后及疗效评定具有重大意义。CTCs为现阶段膀胱癌特异性血清标志物，因恶性肿瘤细胞可入侵至周围组织中，进入淋巴管及血液系统中，并转运至远端组织中，形成病灶，CTCs能反映出转移的实时情况[16-17]。研究表明，Ⅲ期或Ⅳ期膀胱癌进行CTCs 检测具有更大的临床价值[18]。本研究对我院接收的58 例膀胱癌患者依据TNM 分期、年龄、病理类型(导管浸润型、小叶浸润型)、分化程度、脉管侵犯、神经侵犯、性别进行划分，结果显示膀胱癌患者不同性别、病理类型、年龄、分化程度及肿瘤大小间，CTCs 阳性率比较差异无统计学意义(P＞0.05)；患者TNM 总分期(Ⅲ期+Ⅳ期)、T3+T4、N1+N2+N3、M1、脉管侵犯及神经侵犯患者中CTCs阳性率明显高于Ⅰ期+Ⅱ期、T1+T2、N0、M0及无脉管侵犯和神经侵犯者，差异有统计学意义(P＜0.05)。这与葛海燕等[19]提出的研究结论具有同质性，本研究与其对比具有一定的优势，因本研究增加了TNM 总分期患者检测CTCs 计数对比，发现CTCs 计数随着TNM 分期的升高而增加。

综上所述，膀胱癌患者CTCs 表达与肿瘤分期存在密切的关系，肿瘤TNM 分期越高，CTCs 计数越高，表明CTCs 可作为膀胱癌患者临床诊断的重要指标之一。