组蛋白去乙酰化酶3在小鼠心肌纤维化中的作用及机制研究

向家培，雷玉华

恩施土家族苗族自治州中心医院心血管内科，湖北 恩施 445000

心脏纤维化是多种心血管疾病的共同病理特征，包括高血压、心肌梗死、扩张性心肌病和糖尿病心肌病[1]，细胞外基质和胶原蛋白的大量产生和沉积是心肌纤维化的主要病理特征[2]。目前，许多研究都已经证实了转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号通路在心肌纤维化发生发展中的重要地位[3]。细胞外的TGF-β可通过活化心脏成纤维细胞上的Ⅰ型和Ⅱ型TGF-β受体进而磷酸化胞浆内的Smad2和Smad3。一旦Smad2 和Smad3 被磷酸化，两者将与Smad4 形成复合体进入细胞核，诱导促纤维化相关基因的转录激活[4]。因此，阻断TGF-β/Smad信号的活化是预防和治疗心肌纤维化的主要策略之一。

组蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3，HDAC3)是组蛋白去乙酰化酶家族的重要成员之一，可通过催化组蛋白去乙酰化，影响染色质结构稳定性并调控基因表达[5-6]。在肾脏纤维化时，肾小管上皮细胞中的HDAC3蛋白表达水平明显升高，而敲低HDAC3可明显抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转分化，进而抑制肾脏纤维化的进展[7]，但HDAC3在心肌纤维化中的作用目前尚未被报道。本研究通过构建异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)诱导小鼠心肌纤维化模型,观察HDAC3 在小鼠心肌组织中的表达状况，并使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966干预，探讨HDAC3影响心肌纤维化的作用及机制，旨在为今后心肌纤维化的预防及治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 RGFP966 (纯度：99.81%，批号：HY-13909)和ISO(纯度：98.61%，批号：HY-B0468)均购自于上海MedChemExpress 公司；一抗：GAPDH(批号：ab8245)、Klotho(批号：ab181373)、P-Smad3(批号：ab52903)、T-Smad3 (批号：ab208182)、α-SMA(批号：ab5831)、HDAC3 (批号：ab32369)购自于美国Abcam 公司；二抗：羊抗兔IgG(批号：926-32211)购自于美国LICOR 公司。

1.2 实验动物及心肌纤维化模型的建立 本实验中所使用的动物为雄性C57BL/6J小鼠，购自于湖北省实验动物研究中心。小鼠周龄10～12 周，体质量236～311 g。根据随机数表法将40只小鼠随机分为对照组(Sham 组)、RGFP966 组、ISO 组、ISO+RGFP966组,每组10只。ISO组和ISO+RGFP966组小鼠接受皮下注射ISO (1 mg/kg，bid)，连续14 d。RGFP966 及ISO+RGFP966组小鼠于ISO注射当天开始，每天下午接受皮下注射RGFP966(10 mg/kg，qd)，连续14 d。本实验所有操作获恩施土家族苗族自治州中心医院实验动物护理和使用委员会批准。

1.3 小鼠心脏功能的评价 采用MyLab 30CV多普勒超声诊断仪器对四组小鼠进行无创心功能检测。使用浓度为1.5%的异氟烷对小鼠进行吸入麻醉。待小鼠麻醉成功后，剃去小鼠心前区毛发，充分暴露小鼠皮肤。超声探头频率为30 MHz，分别记录穿过左心室前壁和后壁的M型超声，获取小鼠心脏功能参数，包括射血分数、短轴缩短率(F、左室收缩末期内径和左室舒张末期内径。

1.4 蛋白质免疫印迹法(Western blot) 待测完各组小鼠心脏功能后采用颈椎脱臼法处死小鼠，分离出小鼠心脏，拭去心脏表面血液后，置于-80℃冰箱中保存。待进行Westen blot检测相关蛋白时，剪取各组小鼠心室肌组织约30 mg，充分研磨后在RIPA裂解缓冲液中进行超声裂解。提取各组小鼠心肌组织中的总蛋白。检测各样本蛋白浓度后使用上样缓冲液定容至等浓度，随后分装并置于-80℃冰箱长期保存。分别配制10%的分离胶和6%的浓度胶，对各组小鼠心肌蛋白进行SDS-PAGE电泳。待电泳结束后，将蛋白转入醋酸纤维素膜中，并在4℃下使用牛奶封闭40 min。随后，分别用抗HDAC3、Klotho、P-Smad3、T-Smad3、α-SMA 和GAPDH 的一抗于4℃下孵育过夜，随后于二抗稀释液中避光孵育，置于摇床上1 h。使用化学发光法对目的条带显影并定量。

1.5 实时荧光定量PCR 将-80℃冰箱中的心肌组织取出，使用TRIzol试剂盒提取各组小鼠心肌组织总RNA，紫外分光计测定纯度和浓度后对各样本总RNA进行逆转录，获取cDNA。随后，使用ChamQTMSYBR qPCR Master Mix试剂盒对各样本cDNA进行实时荧光定量PCR检测，以β-actin作为内参，用2-△△Ct法计算基因的相对表达水平。各基因引物由Primer premier 5软件设计，引物序列如表1所示。

表1 各基因引物序列

1.6 免疫组织化学染色 将心肌组织石蜡切片经过脱蜡水洗、抗原修复、羊血清封闭、HDAC3 抗体孵育、二抗孵育、DAB显色、脱水、透明及封片等一系列免疫组织化学染色步骤后，在光学显微镜下观察心肌组织中HDAC3表达状并拍照记录。使用Image Pro Plus 6.0软件对心肌组织中HDAC3阳性区域进行定量。

1.7 马松染色 将心肌组织石蜡切片经过脱蜡水洗后，使用苏木素染液浸染5 min，中性盐酸酒精溶液分化5 s，自来水流水冲洗10 min。随后，使用丽春红酸性品红溶液染色4 min，迅速用蒸馏水漂洗3 次。使用磷钼酸水溶液孵育3 min，苯胺蓝染色5 min，1%冰醋酸孵育1 min。蒸馏水漂洗后，脱水、透明及封片并在光学显微镜下观察拍照。使用Image Pro Plus 6.0软件对心肌组织中胶原纤维进行定量。

1.8 统计学方法 应用SPSS26.0 软件分析实验数据，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(x-±s)表示，组间两两比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌纤维化组织中HDAC3 蛋白的表达状况 免疫印迹Western blot结果(图1A)显示，ISO组小鼠心肌组织中HDAC3 蛋白相对表达量为3.12±0.18，较Sham 组的1.03±0.14 明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；免疫组织化学染色(图1B)进一步证实，ISO组小鼠心肌组织中HDAC3阳性细胞百分比明显高于Sham组[(41.32±2.56)%vs(9.33±1.45)%]，差异有统计学意义(P＜0.05)。

图1 心肌纤维化小鼠心脏组织中HDAC3的蛋白表达状况(×200)

2.2 各组小鼠心脏功能比较 与Sham 组相比，ISO 组小鼠射血分数和短轴缩短率明显降低，左室舒张末期内径和左室收缩末期内径明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与ISO组小鼠相比，ISO+RGFP966组小鼠射血分数和短轴缩短率明显增加，左室舒张末期内径和左室收缩末期内径明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组小鼠心功能比较()

表2 各组小鼠心功能比较()

注：与Sham组比较，aP＜0.05；与ISO组比较，bP＜0.05。

2.3 各组小鼠心肌纤维化比较 马松染色结果显示,与Sham 组相比，ISO 组小鼠心肌组织中胶原沉积明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；相反，经RGFP966 干预后，心肌纤维化小鼠心肌组织中胶原沉积明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2 和表3。实时荧光定量PCR 进一步显示，RGFP966 干预可明显抑制ISO 导致的心肌组织Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ和CTGF 的mRNA 表达增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 各组小鼠心肌组织中胶原沉积及纤维化标志分子的mRNA相对表达水平比较()

表3 各组小鼠心肌组织中胶原沉积及纤维化标志分子的mRNA相对表达水平比较()

注：与Sham组比较，aP＜0.05；与ISO组比较，bP＜0.05。

图2 各组小鼠心肌纤维化马松染色结果(×200)

2.4 RGFP966减轻小鼠心肌纤维化的机制 与Sham 组相比，ISO 组小鼠心肌组织中Klotho 蛋白明显降低，磷酸化的Smad3 (P-Smad3)及α-SMA 的蛋白明显增加，差异具有统计学意义(P＜0.05)；相反，RGFP966 干预可明显上调心肌纤维化小鼠心肌组织中Klotho 的蛋白水平，下调P-Smad3 及α-SMA 的蛋白水平，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图3 和表4。

图3 各组小鼠心肌纤维化组织相对蛋白表达比较

表4 各组小鼠心肌组织中不同蛋白指标的相对含量比较()

表4 各组小鼠心肌组织中不同蛋白指标的相对含量比较()

注：与Sham组比较，aP＜0.05；与ISO组比较，bP＜0.05。

3 讨论

本研究首次揭示在ISO 诱导的小鼠心肌纤维化中，心肌组织中HDAC3的蛋白表达明显升高。同时，本研究观察到HDAC3特异性抑制剂RGFP966具有抑制ISO 相关心肌纤维化的作用，并进一步探讨了RGFP966抗心肌纤维化的可能机制。既往研究显示，在心肌发生纤维化期间，心脏成纤维细胞可产生大量的胶原纤维，沉积于心肌细胞外基质[8]。此外，心脏成纤维细胞在某些促纤维化因素(如ISO，TGF-β及高糖)的刺激下，也可转分化为高表达α-SMA的肌成纤维细胞，这也是导致细胞外基质沉积的重要原因之一[9-10]。TGF-β是目前研究最为深入的促纤维化因子，其存在有3 种不同的亚型，分别为TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3。TGF-β可通多种机制诱导心肌纤维化。除了增加胞外基质的沉积并抑制其降解，TGF-β还参与了多种促纤维化细胞因子的表达[11]。

目前，已经公认的心肌纤维化模型主要包括以下6种：(1)自发性高血压大鼠；(2)糖尿病心肌病；(3)胸主动脉缩窄；(4)心肌梗死；(5)二肾一夹及肾下主动脉缩窄；(6)ISO 皮下注射[12]。动物模型的高仿性，稳定性和易操作性是心血管疾病研究的首要考虑因素。相比于前5种模型，ISO模型的建立动物死亡率低，操作方法更为简便，造模周期也相对较短，且更加接近于疾病进程。机制上，ISO 刺激可导致小鼠心肌组织中TGF-β的表达增加，促进心肌纤维化的发生[13-14]。因此，本研究选择了ISO诱导的小鼠心肌纤维化模型，观察到HDAC3 蛋白在ISO 皮下注射14 d 后表达水平明显增加，这就提示HDAC3 可能参与了小鼠心肌纤维化发生发展的进程。

在哺乳动物中，组蛋白的乙酰化受到组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferases，HATs)和HDACs 的动态调控。一般而言，HDACs通过去乙酰化赖氨酸残基和恢复染色质组蛋白的正电荷导致染色质凝聚，阻碍转录因子的进入，最终抑制相关基因表达[15]。在肾脏纤维化形成过程中，HDACs的上调可影响促纤维化生长因子、细胞信号分子、细胞外基质蛋白和肾脏抗纤维化蛋白的表达。例如，HDACs抑制剂可明显上调抗纤维化蛋白Klotho 及BMP-7 的水平，最终抑制肾脏纤维化的进展[16]。最近的一项研究表明，肾小管上皮细胞HDAC3特异性敲除或使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966均可减轻输尿管结扎引起的肾脏纤维化，其机制可能与HDAC3对抗纤维化蛋白Klotho的抑制有关[7]。与该研究一致，本研究首次揭示RGFP966 可明显上调心肌纤维化小鼠心脏组织中Klotho 的蛋白表达，同时减轻小鼠心肌纤维化。笔者推测，RGFP966可能通过Klotho介导的TGF-β/Smad信号通路阻断发挥抗纤维化作用。但本研究仍旧存在一定的局限性。首先，本研究只在在体水平探讨了HDAC3 抑制对小鼠心肌纤维化中的作用，没有离体实验数据进一步验证；其次，尽管本研究使用的RGFP966是HDAC3特异性抑制剂，但RGFP966 对HDAC3 活性抑制效率和特异性均有限，因此后续需要进一步构建HDAC3基因敲除小鼠进一步验证HDAC3在心肌纤维化中的作用；再者，HDAC3 如何抑制Klotho 表达也需要更深入的研究进行探讨。

总之，本研究首次证实了HDAC3抑制可改善ISO诱导的小鼠心肌纤维化。HDAC3 可能通过抑制心肌组织抗纤维化蛋白Klotho，进而放大TGF-β/Smad 信号,最终导致小鼠心肌纤维化的发生。但仍需要更深入的实验进一步探讨HDAC3调控Klotho的精确的分子靶点。