高效液相色谱法检测玉米面制品中柠檬黄色素的研究*

孙 悦，廖若宇，刘新保，张春娥*，杜晓楠

（1.宁夏回族自治区粮油产品质量检测中心，银川 750001;2.宁夏回族自治区食品质量监督检验二站，银川 750001）

玉米作为全球第一大谷物，营养丰富，堪称“五谷之首”。据统计，全球有三分之一的人口以玉米作为主食。玉米面是时下较为常见的粗粮食品，不仅可以完全保留玉米的营养成分和保健功能，还能有效地改善食品口感。但有些商贩在玉米面食品的加工中，添加人工合成着色剂柠檬黄[1]，大量或长期食用会对人体有害[2－4]，引起过敏、腹泻等症状，特别是对新陈代谢能力较弱的老人、孕妇、小孩等会造成身体损伤[5]。

柠檬黄作为我国允许使用的合成色素，国家标准GB 2760－2014（食品安全国家标准 食品添加剂使用标准）规定其使用限量为0.08 g/kg[6]。常采用的检测其含量的方法有分光光度法[7－8]、薄层色谱法[9]、拉曼光谱法[10－11]以及高效液相色谱法[12－13]等。提取方法主要有溶剂提取法[14]、聚酰胺吸附法[15]以及固相萃取法[16－17]等。本文参考国家标准 GB/T 5009.35－2016（食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定）18]，采用在不破坏食品本身性质的条件下以碳酸氢钠[19]作为辅助提取试剂，结合去离子水为主要提取试剂，建立玉米面制品中柠檬黄色素的高效液相色谱分析方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

朝鲜族民俗玉米面条；产地：吉林省延边朝鲜族自治区；生产许可证号：SC10122240130174；产品标准：Q/YJSX 0001S；玉米面（超市内购得）。

柠檬黄溶液（GBW（E）100001a） 0.500 mg/mL，中国计量科学研究院；甲醇（色谱级），赛默飞世尔科技（中国）有限公司；甘油，成都市科隆化学品有限公司；1，2－丙二醇，成都市新都区木兰镇工业开发区；无水乙醇，95%乙醇，安徽安特食品股份有限公司；乙酸铵，天津市光复科技发展有限公司；碳酸氢钠，广东省化学试剂工程技术研究开发中心，以上试剂为分析纯；氯化钠，天津市光复科技发展有限公司；无水碳酸钠，山东西亚化学股份有限公司；乙酸钠，天津市光复科技发展有限公司，以上试剂为优级纯，实验室用三级水。

1.2 仪器设备

Prominence UFLC高效液相色谱仪配二极管阵列检测器：岛津集团；LABORATORY MILL3100（Perten）实验磨：瑞典波通仪器公司；PL602－L 电子天平（1/100）：梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；HY－5回旋式振荡器：江苏省金坛市环宇科学仪器厂；QT－1旋涡混合器：上海琪特分析仪器有限公司；QL－20G－C高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；COMFORT纯水/超纯水机：成都浩康科技有限公司；C300A真空泵：德国WGIENS；5 mL一次性注射器：江苏长城医疗器械有限公司；13 mm 0.22 μm聚醚砜针式滤器：上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线制作

取柠檬黄标准溶液（0.5 mg/mL）200 μL，加水定容至1 mL后得到浓度为100 μg/mL的标准储备工作溶液，稀释标准储备工作溶液制备标准系列浓度为 0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL 的系列标准曲线点。

1.3.2 样品的前处理

试样经锤式旋风磨粉碎。称取5.00 g试样和1.00 g 碳酸氢钠（精准至 0.01 g）于 100 mL 离心管中，加入25 mL水振荡提取10 min，离心5 min，转速为6 000 r/min，收集上清液于100 mL比色管中，反复提取并收集上清液共计四次，混匀后取1 mL提取溶液过0.22 μm水相针式过滤器上机分析。

1.3.3 色谱条件

色 谱 柱 ：YWG C18 柱 （4.6 mm×250 mm，10 μm）；二极管阵列检测器：波长范围为190～800 nm，柠檬黄检测波长选取429 nm；柱温：35℃；流动相：甲醇：乙酸铵(13:87，V/V)，等度洗脱，流速为1.0 mL/min，进样量为 10 μL。

1.3.4 色谱分析

准确吸取柠檬黄标准溶液10 μL注入色谱仪，以保留时间定性，以峰面积标准曲线定量。标准溶液色谱图见图1。

1.3.5 单因素实验条件的优化

（1）检测波长的确定：选取 254nm、427nm、428nm、429nm、430nm和450nm六种检测波长对色谱图响应值及峰型的影响。

（2）提取试剂：采用方法1.3.2处理样品，考察不同比例的甘油－无水乙醇、1，2丙二醇－无水乙醇、45%乙醇－水、45%甲醇－水和去离子水五种提取试剂对样品加标回收率的影响。

（3）提取方式：采用方法1.3.2处理样品，考察涡混5 min、振荡10 min和振荡20 min三种不同的提取方式对样品加标回收率的影响。

（4）提取次数：采用方法1.3.2处理样品，考察分别提取一次、二次、三次、四次和五次对样品加标回收率的影响。

（5）辅助试剂的选择：采用方法1.3.2处理样品，考察碳酸氢钠、氯化钠、碳酸钠和乙酸钠这四种辅助的提取试剂对样品加标回收率的影响。

（6）碳酸氢钠用量的选择。采用方法1.3.2处理样品，考察添加 0.0 g、0.4 g、0.8 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g和2.5 g的碳酸氢钠对样品的加标回收率的影响。

1.3.6 正交实验设计

采用单因素实验选择最优的提取条件，对提取次数(A)、碳酸氢钠的用量(B)以及提取方式(C)这三个因素进行三因素三水平的正交实验设计。

1.3.7 样品的加标回收实验及方法验证

通过添加不同梯度的柠檬黄标准溶液，对优化后的提取工艺进行验证实验。优化后的提取工艺与国家标准方法的提取工艺比对。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 检测波长对加标回收率的影响

实验考察了1.3.3色谱条件中对检测波长的确定。查阅相关文献，选取254 nm、427 nm、428 nm、429 nm、430 nm和450 nm六种检测波长对样品加标回收率的影响。在柱温35℃；流动相：甲醇：乙酸铵 13:87(V/V)，等度洗脱，流速为 1.0 mL/min，进样量为10 μL的条件下，得出结果。在检测波长为429 nm时，有较强的吸收强度，出峰时间短，峰型较好，干扰少。

2.1.2 提取试剂对加标回收率的影响

考察了不同比例的甘油－无水乙醇、不同比例的1，2丙二醇－无水乙醇、45%乙醇－水、45%甲醇－水以及水对样品加标回收率的影响，加标浓度为1.25 μg/mL。由图 2可知，不同比例的甘油－无水乙醇的加标回收率在46.72%～66.32%之间；不同比例的1.2丙二醇－无水乙醇的加标回收率在27.28%～63.52%之间；45%－乙醇－水的加标回收率为67.92%；45%甲醇－水的加标回收率为 93.28%；水的加标回收率为96.32%。数据结果表明：不同比例的1，2丙二醇－无水乙醇＜不同比例的甘油－无水乙醇＜45%－乙醇－水溶液＜45%甲醇－水＜去离子水（如图2所示）。目前粮食检测行业以环保为主，因此，选择用去离子水提取更符合绿色发展的理念。

2.1.3 提取方式对加标回收率的影响

实验考察了涡混和振荡两种提取方式对样品加标回收率的影响，加标浓度为 1.25 μg/mL。分别测定涡混5 min、振荡10 min和振荡20 min的样品加标回收率。测定结果如图3，涡混5 min后的样品加标回收率为90.88%，振荡10 min后的加标回收率为91.04%，振荡 20 min后的加标回收率则减为90.72%。测试结果表明：振荡20 min的加标回收率最高，但缺点是提取耗时太长，涡混5 min和振荡10 min的加标回收率基本相同，两种提取方式均可取。在实际检测工作中，对于提取方式，可根据试验数量灵活选择。最终，对于大批量风险监测任务，建议选择振荡10 min提取方式，可以提高工作效率。

2.1.4 提取次数对加标回收率的影响

实验考察了分别提取一次、二次、三次、四次及五次对样品加标回收率的影响。对应的加标浓度分别为：5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.67 μg/mL、1.25 μg/mL和1.00 μg/mL。观察每次提取完毕后样品基质颜色，测定相应的加标回收率。测定结果如图4，提取后加标回收率分别为：41.60%、68.64%、95.66%、96.48%、95.88%。结果表明：提取次数少，不足以将样品中柠檬黄提取完全，样品经第4次提取，观察样品基质颜色，样品提取干净，样品经第5次提取，测定结果与第4次相比，加标回收率变化不大，综合工作效率，选择反复4次提取效果最好，加标回收率也最高。

2.1.5 不同的辅助提取试剂对加标回收率的影响

实验考察了不同的辅助提取试剂对加标回收率的影响，加标浓度为1.25 μg/mL。从图 5中可以看出，不同的辅助提取试剂对样品加标回收率的影响为：碳酸氢钠＞氯化钠＞碳酸钠＞乙酸钠。数据结果显示，经过对提取后的试样观察，碳酸氢钠提取完毕后，样品中残留的颜色较浅，最终选取碳酸氢钠作为本次实验的辅助提取试剂。

图5 不同辅助提取试剂对加标回收率的影响

2.1.6 碳酸氢钠添加量对加标回收率的影响

实验考察了添加 0.0 g、0.4 g、0.8 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5g的碳酸氢钠对加标回收率的影响，加标浓度为1.25 μg/mL。从图 6中可以得出，不添加碳酸氢钠，样品提取效果不佳，加标回收率小于50%。添加碳酸氢钠的用量在0.4～0.8 g之间时，对应的加标回收率处在88.16%～89.12%之间，碳酸氢钠用量增至1 g时，加标回收率升为90.16%，碳酸氢钠用量继续 增长到 1.5～2.5 g 之间时，加标回收率 在86.24%～89.12%之间。数据结果显示：添加的碳酸氢钠量较少时，提取效果不佳；碳酸氢钠的量超过1 g之后，加标回收率降低；而碳酸氢钠添加量适中时，加标回收率最高，提取效果最好。经查阅资料得知，碳酸氢钠遇水显碱性，使用过多会影响样品本身的性质以及食用口感等，因此，碳酸氢钠的用量为1 g时最为合适。

图6 碳酸氢钠用量对加标回收率的影响

2.2 正交试验

根据单因素实验的结果，以提取次数、碳酸氢钠的用量以及提取方式为考察因素，以柠檬黄的加标回收率为响应指标，选择L9（34）正交试验，进行三因素三水平的正交试验，（每组设置3个平行因素），正交试验因素水平见表1。正交试验结果见表2。

表1 因素水平表

表2 正交实验设计及结果

由正交试验可以看出各因素对柠檬黄的加标回收率的影响顺序为A＞B＞C，即提取次数＞碳酸氢钠的用量＞提取方式，提取柠檬黄的最优组合为A3B2C2，即提取次数为5次，碳酸氢钠用量为1.0g，提取方式为振荡10 min。因此最终确定的最优组合为A2B2C2，即提取次数为4次，碳酸氢钠用量为1.0 g，提取方式为振荡10 min。因素主次顺序为A→B→C。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程与检出限

柠檬黄标准溶液0.5 mg/mL，配制浓度点分别为 0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL 和 15 μg/mL 的标准工作液，按1.3.3色谱条件测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合，得到柠檬黄的线性方程为：f（x）=29 890.8x－1 575.08，R2=0.9999，RSD=1.88。按3倍信噪比计算检出限，得到仪器的检出限为0.08 mg/kg，按10倍信噪比计算方法定量限，得出方法定量限为：0.24 mg/kg。

2.3.2 方法的精密度及稳定性

确定检测条件后，在 1.25 μg/mL、3.75 μg/mL 和7.5 μg/mL的三个加标水平上，考察方法的精密度和稳定性。重复2 d测定，每天测定6次，测得的结果如表3所示。本方法的加标回收率在89.55%～93.76%，RSD 值在 0.08%～0.36%之间。结果显示，采用该色谱条件对样品测试时，稳定性良好，该条件下的方法具有良好的重复性，较高的精密度。

表3 方法的精密度和稳定性（n=6）

2.4 样品的加标回收试验及方法验证

2.4.1 样品的加标回收试验及样品方法验证

由表4可知，针对两种不同的玉米面样品，样品本身不含柠檬黄色素，结果显示该方法下不同浓度的加标回收率在 89.49%～94.32%之间，RSD 值在0.02%～0.32%之间。验证了检测前处理方法准确性高，符合检测要求。

表4 加标回收试验（n=6）

2.4.2 实际样品的验证方法与国家标准方法的比对

根据国家标准方法GB 5009.35－2016（食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定）与该实验优化后的检测方法比对。首先，从色谱条件来看，国家标准同时测7种着色剂，虽然检测色素种类多，但出峰时间过长。本次实验检测柠檬黄出峰时间短，采用等度洗脱，简便且高效。其次，从前处理过程看，国家标准方法需要调节样品pH值，用聚酰胺吸附法对样品进行复杂的净化过程。而优化后的方法只需以去离子水作为提取液，添加碳酸氢钠为辅助对样品进行前处理，该过程没有有机试剂的加入，操作简便又环保。最后，从方法学考察看，国家标准方法中柠檬黄的方法检出限为0.5 mg/kg，而本次实验的方法检出限为 0.08 mg/kg，定量限为 0.24 mg/kg，加标回收率符合标准范围。该方法更灵敏，精密性、重现性要优于国家标准方法。

3 结论

本次实验采用无污染且环保的超纯去离子水作为提取液，碳酸氢钠为辅助提取试剂，样品与碳酸氢钠以5:1的比例称取，振荡10 min，离心5 min，转速6 000 r/min，反复四次提取上清液，混匀后取1 mL过0.22 μm亲水性滤膜，采用方法1.3.3的色谱条件上机分析。结果显示本研究玉米面中未检测出柠檬黄色素，前处理方法有较好的线性关系，加标回收率在89%～94.3%之间，而且过程简便，高效率，适合大批量试验检测，样品的稳定性较好，方法准确度高，仪器精密性好，可为检测面制品中的柠檬黄提供技术指南。