浓缩生长因子和根管冲洗液对牙髓细胞的保护及贴附作用

殷亮亮 李春年

牙髓是位于牙髓腔内的疏松结缔组织，因此牙髓一旦受到微生物的感染，易引发牙髓根尖周病，对牙根未发育完成的年轻恒牙，临床上传统治疗方法是根尖诱导成形术和根尖屏障术[1]。但二者都不能使牙根继续发育，往往造成冠根比例失调，根管壁薄弱等不良预后。随着组织工程、生物材料的发展以及牙髓干细胞的成功培养，牙髓血运重建技术已成为恒牙发生牙髓病、根尖周疾病后的理想治疗方法。支架是牙髓组织工程重要的组成部分，浓缩生长因子(CGF)是第三代血小板聚集物，与前两代血小板浓缩制品相比，CGF具有更好的再生能力和多功能性[2-5]。牙髓再生治疗的根管化学预备与常规根管不同，使用冲洗液时不仅要考虑到其杀菌作用，还应注意减小冲洗液的细胞毒性，保护进入根管中的干细胞，同时应注意冲洗对根管壁释放生长因子的影响。目前临床上常用的根管冲洗剂包括抗菌剂次氯酸钠、氯己定以及金属螯合剂EDTA等。因此，通过本研究观察CGF对于牙髓细胞增殖和分化的作用，探索CGF在牙髓血运重建术中的作用，并探究使用不同的根管冲洗液处理根管的效果，观察冲洗后的根管对牙髓细胞贴附根管壁的影响，以期对提高牙髓血运重建术的预后有积极的指导意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料 口腔颌面外科门诊因正畸需要拔出的前磨牙或智齿。纳入标准：患者年龄为14～18岁，未做过充填治疗和牙髓治疗，无龋坏，无根裂。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 主要实验仪器设备：细胞培养箱，美国Thermo公司；超净工作台，Thermo Eleetron公司倒置相差显微镜，德国ZEISS公司；Synergy-TH酶标仪，美国Biotech公司；低温高速离心机，美国Thermo公司；YP2001N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；低速离心机，北京医用离心机厂；高压蒸汽灭菌器，日本松下健康医疗器械株式会社。

1.2.2 主要实验器材：25 cm2培养瓶，ThermoFisher，美国；75 cm2培养瓶，ThermoFisher，美国；6孔细胞培养板，美国Corning公司；96孔细胞培养板，美国Corning公司。

1.2.3 主要试剂：胎牛血清，以色列BI公司；高糖DMEM培养液，美国Gibico公司；青、链霉素混合液，以色列BI公司；胰蛋白酶，美国Gibico公司；PBS磷酸盐缓冲液，以色列BI公司；CCK-8试剂盒，中国碧云天生物技术研究所；碱性磷酸酶(ALP)试剂盒，中国碧云天生物技术研究所；次氯酸钠，朗力生物医药有限公司；17%EDTA溶液，朗力生物医药有限公司；0.2%氯己定，朗力生物医药有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 离体牙取材:牙齿拔除后自根尖部至冠部碘伏消毒3遍，高速手机和无菌水冷却在牙颈部制备环形沟槽，不能穿髓，制备完成后将离体牙立刻置于预冷的含有1%双抗的基础培养基中，1 h内转运至实验室对牙髓组织取材，进行原代细胞培养。

1.3.2 牙髓细胞培养:将收集的离体牙用含有2%双抗(200 g/ml青霉素和200 g/ml链霉素)的PBS溶液清洗3遍，用技工剪沿着牙颈部预磨好的凹槽剪断，拔髓针取出牙髓后剪去根尖区2 mm的牙髓，剩余的牙髓组织用含1%双抗PBS溶液清洗3遍，将清洗干净的牙髓组织用无菌眼科剪剪碎，使组织块体积约为 0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，移入15 ml离心管中，加入1 ml的Ⅰ型胶原酶(3 g/L)和中性蛋白酶(4 g/L),置于37℃，5%CO2培养箱中孵育，消化约40 min，每隔15 min吹打组织块，使组织块与酶充分接触，直到组织块消化为棉絮状，然后加入3 ml含10%FBS的培养液终止消化，并进行吹打，充分接触。将离心机设置为1 000 r/min，离心5 min，去除上清液，加入3 ml的含10%FBS的培养液重悬，将悬液接种于8 cm2培养皿中，在37℃，5%CO2细胞培养箱内培养。3 d更换1次培养液，细胞生长汇合至80%时，用胰蛋白酶消化传代。

1.3.3 牙髓细胞的传代:在倒置显微镜下观察细胞外形及细胞状态，原代牙髓细胞生长至80%时，可进行传代。在超净工作台下用1%双抗PBS荡洗培养皿3遍,清洗力度要轻柔，防止细胞损伤。然后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，溶液量要达到与培养皿底细胞充分接触，在37℃恒温培养箱孵育2 min，在显微镜下及时观察，当贴壁细胞趋于圆形、细胞开始少量飘起时，加入2～3倍胰蛋白酶溶液体积的完全培养基终止消化。用巴氏吸管将皿底的细胞充分吹打，使细胞从皿底脱壁，移入离心管中，将离心机设置为1 000 r/min，离心5 min，去除上清液，加入3 ml的含10%FBS的培养液重悬，按1∶2或1∶3进行传代，加入适量培养液，混匀后于37℃恒温培养箱中培养，24 h后换液，之后每3天换液，牙髓细胞生长至80%时，进行下一次传代。

1.3.4 CGF的制备:①采血：采集7～8 ml血液，注入不含添加剂的真空试管中，避免摇晃以免发生溶血反应。②离心:配平后立即将试管和配平试管对称放置于Medifuge离心机中，选择CGF制备程序，差速离心13 min，具体离心过程如下：加速30 s；2 700 r/min，2 min；2 400 r/min，4 min；2 700 r/min，4 min；3 000 r/min，3 min；减速36 s到停止状态。按程序离心一定时间后，再静置10 min使分层更稳定。试管中血液标本分为三层，最上层为淡黄色血清，中间层为纤维蛋白层(即浓缩生长因子CGF)、底层为富血小板凝固层(含红细胞和血小板)。③分离CGF块:过滤血清并修剪富血小板凝固层，保留少量血浆层，获得浓缩生长因子块状标本。④制备CGF膜:将分离出来的块状浓缩生长因子压制成膜状浓缩生长因子。无菌眼科剪修剪CGF膜至3 mm×3 mm大小置于无菌0.9%氯化钠溶液中备用。

1.4 CGF对牙髓细胞增殖的影响 实验分为1个对照组，3个实验组。对照组不加CGF，实验组分别加入1、2、3片CGF纤维蛋白膜，使实验组分为低浓度组、中浓度组、高浓度组。取第4代牙髓细胞悬液调整至合适密度，接种于6孔板内，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，使细胞贴壁，在实验组样本孔内分别加入相应的CGF和培养液，对照组仅加入含10%FBS的培养液，每组各设3个复孔，每孔加液量为2.5 ml，将细胞置于培养箱中继续培养，每3天换1次液，分别于第3、5、7天吸去原培养液，PBS清洗3遍后，0.25%胰蛋白酶溶液消化，每孔加入3 ml 含10%FBS DMEM培养液,取600 μl/孔细胞悬液与600 μl正常培养液混匀，以200 μl/孔细胞悬液接种到96孔板中，每组各设3个复孔，培养箱培养24 h后，吸去原培养液，加入100 μl 含10%FBS DMEM培养液和10 μl CCK-8溶液，培养箱内孵育2～4 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长的OD值。相同实验条件下重复3次。

1.5 CGF对牙髓细胞分化的影响 取生长良好的第4代细胞，制备密度合适的细胞悬液接种至12孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，使细胞贴壁，吸去原培养液，PBS清洗3遍，按照实验分组加入相应的CGF和培养液，每组设置3个复孔，每3天换液，分别在第3、5、7天终止培养，取样检测；吸去培养液，PBS清洗3遍，加入250 μl/孔RIPA裂解液，同时反复吹打，提取细胞蛋白。根据ALP试剂盒说明书，按照不同分组分别将蛋白样品加入96孔板内，每孔30 μl，再分别加入基质液和缓冲液各50 μl，37℃孵育15 min，加入显色剂150 μl，酶标仪检测在520 nm波长下的吸光度值(OD值)。相同实验条件下重复3次。

1.6 不同的根管冲洗液处理根管后对牙髓细胞贴附根管壁的影响 高速金刚砂车针将收集的因正畸拔除的下颌离体前磨牙开髓，拔髓，在釉牙骨质界处用金刚砂盘去牙冠，保留牙根，分为3组，分别用次氯酸钠、氯己定、EDTA冲洗，金刚砂盘纵向剖开离体牙牙根，暴露根管壁，截成1 mm×1.5 mm×1.5 mm大小的牙本质片，备用。将实验分为次氯酸钠组、CHX组、EDTA组。将3组牙本质块用75%乙醇浸泡15 min，PBS冲洗3遍，放置于96孔板中。选用第4代生长状态良好的牙髓细胞，0.25%胰蛋白酶消化后制取细胞悬液，以2×104个/ml密度接种至96孔板内，每孔200 μl。培养箱培养48 h后，吸去孔中培养液，用PBS清洗3遍，每孔加入100 μl培养液和10 μl CCK-8溶液，培养箱内孵育2～4 h，用酶标仪检测各孔450 nm波长的OD值。相同实验条件下重复3次。

2 结果

2.1 牙髓细胞形态 倒置显微镜下观察发现，用改良组织块酶消化法进行原代牙髓细胞培养，原代培养第3天，可见牙髓细胞从组织块边缘爬出，成放射状，原代细胞培养第14天左右基本长满，细胞呈长梭形，纤维状。细胞数量较多时呈放射状或旋涡状，生长汇合至80%时可进行传代。见图1～3。

图1 人牙髓细胞原代培养第3天(倒置显微镜×200) 图2 人牙髓细胞原代培养第7天(倒置显微镜×200) 图3 人牙髓细胞原代培养第7天(倒置显微镜×200)

2.2 CGF对牙髓细胞增殖的作用 CCK-8检测OD值，实验组与对照组比较，CGF能够促进牙髓细胞的增殖，并随时间延长和CGF剂量的增加牙髓细胞的增殖能力也增强。第3天实验组和对照组牙髓细胞的增殖作用差异无统计学意义(P>0.05)。实验第5、7天时，实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图4。

表1 随着时间变化不同浓度的CGF作用于牙髓细胞的CCK-8值 OD值，

图4 CCK-8检测不同浓度CGF对牙髓细胞的增殖作用(a:P<0.05)

2.3 CGF对牙髓细胞分化的影响 ALP试剂盒检测在第7天时CGF组中牙髓细胞的碱性磷酸酶活性高于对照组，并且高浓度CGF组的碱性磷酸酶活性最高，吸光度之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 随着时间变化不同浓度的CGF作用于牙髓细胞的ALP值 OD值，

2.4 根管冲洗液对牙髓细胞贴附根管壁的影响 牙髓细胞培养24 h后，在酶标仪上测定450 nm波长下各孔的吸光度值，结果显示次氯酸钠组吸光度值大于其他2组，且差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 根管冲洗液对牙髓细胞贴附的吸光度值 OD值，

3 讨论

在牙组织工程和再生的各种细胞类型中，牙髓组织中的干细胞被认为是理想的细胞类型[6-8]。牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，DPSCs)除了干细胞的2个主要特征(自我更新和多向分化)外，牙髓细胞在组织工程中的应用还具有其他一些优点[9,10]：(1)这些细胞收集容易，免疫排斥低；(2)从牙髓组织中提取效率高；(3)可塑性强、不涉及伦理问题；(4)它们与生物材料的相互作用已经被证明[11]。目前，牙髓细胞培养的方法主要有酶消化法，组织块法和改良组织块酶消化法。酶消化法与组织块法这2种不同的培养方法会导致牙髓细胞在形态和生长速度上存在差异，酶消化法能产生更有增殖潜力的牙髓细胞并将所有的细胞从组织中释放出来，然而不可避免地会造成一定程度的细胞损伤和数量损失。组织块法需要2周左右的时间才能从组织中迁移出足够数量的细胞，增加了污染机率。本实验采用改良组织块酶消化法分离培养原代牙髓细胞，综合了酶消化法与组织块法的优点，显著缩短了酶消化时间，提高了细胞存活率。

CGF是在2006年首次研制成功的第3代浓缩血小板，通过特殊的离心程序，CGF具有更高的强度和黏度[12]，可以更好地保护生长因子不被蛋白水解[13,14]。CGF作为组织工程的生物支架材料具有多种纤维蛋白交织而成的三维多孔网状结构，DPCs可以被嵌入支架中以分化成功能性的成牙本质细胞。细胞增殖和分化是组织修复和再生的关键因素。CGF富含多种生长因子，如血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factors，IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors,FGFs)等[15-17]。这些生长因子通过细胞归巢诱导DPCs增殖、分化、迁移并黏附在损伤部位，以取代缺失的成牙本质细胞。CGF的生长因子多样性比单个生物活性蛋白或生物蛋白制剂效果更加理想。本研究采用不同浓度的CGF膜培养DPCs，更贴近于临床应用，实验的结论是CGF逐渐促进了DPCs的增殖和迁移，并与浓度呈正相关。这可能是由于CGF的特殊三维结构的作用，使生长因子可以维持并缓慢释放，延长生长因子的作用，促进细胞增殖。ALP被认为是在骨形成过程中起关键作用的典型成骨标志物，并与早期细胞的成骨分化有关。在本研究中，我们观察到第7天时CGF显著增加了ALP活性。BMP2/SMAD5/Runx2信号通路是与骨重建和骨形成相关的关键信号通路，提示CGF可能是通过上调BMP2、SMAD5和Runx2的蛋白表达来促进DPCs的矿化。

在实施牙髓血运重建过程中，其成功的前提是彻底消毒根管系统。临床上常用的根管冲洗剂包括次氯酸钠、氯己定及金属螯合剂EDTA等。在溶解坏死组织后，抗菌剂次氯酸钠能更好地到达并清洁感染根管，暴露牙本质的胶原纤维，增强宿主细胞在牙本质上的生长，为牙髓血运重建术的成功实施奠定了基础。氯己定能够破坏细菌胞浆膜上的渗透屏障，具有相当强的广谱抗菌和杀菌作用，对于多数革兰氏阳性菌和阴性菌均具有杀灭作用，因此用于根管冲洗消毒中。但氯己定的渗透作用差，不具有组织溶解能力，并且氯己定具有一定的细胞毒性，使用后如不进行无菌0.9%氯化钠溶液的再次冲洗，则会影响细胞生长。EDTA的螯合作用可以有效的清除根管玷污层，但是如果长时间的与根管壁接触也会对牙本质产生腐蚀作用。本实验观察了次氯酸钠、氯己定、EDTA处理根管后牙髓细胞贴附根管壁的情况，结果显示由次氯酸钠处理过的牙本质块CCK-8值大于其他2组，且差异有统计学意义(P<0.05)。提示在牙髓血运重建术中次氯酸钠可作为有效的根管冲洗剂。