miR-126过表达对增生性玻璃体视网膜病变大鼠的干预作用及机制研究

徐智科 李臻 蒲一民

增生性玻璃体视网膜病变是一种临床较为常见的眼科疾病，常见发病部位为机体视网膜组织，主要临床表现为玻璃体混浊，并出现棕色颗粒，视网膜组织僵硬并出现皱褶[1,2]。大量临床研究表明，增生性玻璃体视网膜病变症状的发生发展会导致机体视力出现严重缺损，对患者身体健康、生活质量造成严重影响[3,4]。目前临床较为常用的治疗增生性玻璃体视网膜病变的手段包括手术治疗、药物治疗等，但治疗效果并不理想[5,6]。临床医学尚无一种特效的治疗增生性玻璃体视网膜病变的手段，因此探究增生性玻璃体视网膜病变发病机制，寻找新的治疗靶点，对增生性玻璃体视网膜病变的治疗具有重要意义[7,8]。本文研究中建立增生性玻璃体视网膜病变大鼠模型，靶向调控miR-126表达，旨在探究过表达miR-126对增生性玻璃体视网膜病变的干预效果。

1 材料与方法

1.1 材料 选取40只SD健康雄性大鼠，由吉林大学动物实验中心提供[许可证号：SYXK(吉)2021-0006]，月龄9～10月，平均(9.5±0.4)月；体重219～232 g，平均体重(226.1±5.2)g。在相对湿度45%～55%、温度(24.1±2.2)℃的环境中喂养大鼠1周，光照12 h/d。本文研究获我院伦理委员会批准。主要试剂：兔抗大鼠miR-126、血管内皮生长因子(VEGF)抗体(Gibco公司)；兔抗小鼠TGF-β1抗体(Dako公司)；大鼠抗小鼠超敏C-反应蛋白(hs-CRP)、白介素-17(IL-17)抗体(Invitrogen公司)；小鼠抗大鼠谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)抗体(Hyclone公司)；小鼠抗兔脂质过氧化物(LPO)、丙二酯(MDA)抗体(BD公司)；大鼠抗小鼠E-cadherin抗体(Sigma公司)；大鼠抗兔vimentin、snail抗体(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分组:随机选取10只大鼠作为本文研究正常组，不做任何处理。其余30只大鼠建立增生性玻璃体视网膜病变模型：以大鼠右眼为实验眼。采集大鼠尾部静脉血1 ml制备富含血小板血浆(PRP)。麻醉干预后是大鼠右眼暴露于术野之中，于显微镜下操作，自距角膜缘2 mm位置向大鼠玻璃体内注入1 U透明质酸酶，10 min后玻璃体液化，自距角膜缘2 mm位置向大鼠玻璃体内注入20 μl PRP，7 d后注射20 μl 0.9%氯化钠溶液。miR-126沉默组大鼠尾部静脉注射30 mg/kg antagomiR-126，miR-126过表达组大鼠尾部静脉注射30 mg/kg agomiR-126，正常组、模型组大鼠大鼠尾部静脉注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.2.2 血流动力学变化检测:所有大鼠干预结束后，对大鼠右眼进行彩色多普勒检查，检测指标包括血流动力学指标收缩期峰值血流速度(Max)、舒张末期流速(Min)、平均血流速度(TAMx)。

1.2.3 标本制备、HE染色:取各组大鼠尾部静脉血2 ml,2 000 r/min离心处理15 min后分离上清液，在-80℃环境中保存待检。对4组大鼠进行麻醉处理后，断头法处死，取大鼠眼球，取出球外组织，固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常规石蜡包埋及连续切片。将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入不同浓度的乙醇中各复水3 min。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸乙醇分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，使用乙醇进行脱水处理后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜进行观察。

1.2.4 miR-126、VEGF mRNA表达检测:RT-PCR检测miR-126、VEGF mRNA表达。提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，逆转录处理后获得cDNA，使用Primer5.0软件设计引物，采用-△△Ct方法计算，内参U6。设置反转录反应条件：25℃ 10 min,40℃ 60 min,85℃ 5 min；设置扩增条件:94℃ 20 s、72℃ 30 s、60℃ 30 s,35个循环，采用2-△△Ct方法计算出需要检测的miR-126、VEGF mRNA表达量。

1.2.5 酶联免疫吸附实验法检测hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平:将待测标本置于室温后，标记酶标板，制作标准品，然后取出试剂盒，以1∶2的稀释液稀释样品；在反应孔上依次加入稀释好的待测血清和标准品100 μl/孔，放置37℃恒温孵育箱中湿育2 h；然后用专用的洗涤液将反应板清洗3次以后，再加入抗体工作液(1∶100倍稀释后)100 μl/孔，放于37℃恒温孵育箱中湿育45 min；继续清洗反应板4次后，在反应孔内加入TMB溶液100 μl/孔，置于37℃恒温孵育箱中湿育45 min后在反应孔内加入终止液100 μl/孔终止反应，在450 nm波长测定吸光度，颜色反应深浅与hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平成正比，经绘制标准曲线计算hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平。

1.2.7 E-cadherin、vimentin、snail相对表达量检测:蛋白质印迹法检测E-cadherin、vimentin、snail表达：取150℃ Ripa裂解液,1.5℃ PMSF冰中孵育30 min,1 500 r/min离心15 min，取上清。每个样品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转入PDVF膜，5%脱脂牛奶常温下密封2 h。加入抗体过夜。取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色，对E-cadherin、vimentin、snail相对表达量进行检测。

2 结果

2.1 4组大鼠眼球组织病理学观察图 正常组大鼠眼球组织结构完好，视网膜结构无变化；模型组、miR-126沉默组大鼠出现严重的视网膜脱落情况；miR-126过表达组大鼠视网膜脱落情况明显改善，眼球组织结构基本完好。见图1。

正常组 模型组 miR-126沉默组 miR-126过表达组

2.2 4组大鼠miR-126、VEGF mRNA表达比较 与正常组比较，模型组、miR-126沉默组、miR-126过表达组大鼠miR-126表达较低，VEGF mRNA表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组、miR-126沉默组比较，miR-126过表达组大鼠miR-126表达较高，VEGF mRNA表达较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠miR-126、VEGF mRNA表达比较

2.3 4组大鼠Max、Min、TAMx水平比较 与正常组大鼠比较，模型组、miR-126沉默组、miR-126过表达组大鼠Max、Min、TAMx水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组、miR-126沉默组比较，miR-126过表达组大鼠Max、Min、TAMx水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠Max、Min、TAMx水平比较

2.4 4组大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平比较 与正常组比较，模型组、miR-126沉默组、miR-126过表达组大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-126沉默组大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平高于模型组，且miR-126过表达组大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平低于模型组、miR-126沉默组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平比较

表4 4组大鼠T淋巴细胞亚群比较

2.6 4组大鼠E-cadherin、vimentin、snail表达比较 与正常组大鼠比较，模型组、miR-126沉默组、miR-126过表达组大鼠E-cadherin表达较低，vimentin、snail表达较高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组、miR-126沉默组比较，miR-126过表达组大鼠E-cadherin表达较高，vimentin、snail表达较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5，图2。

表5 4组大鼠E-cadherin、vimentin、snail表达比较

图2 E-cadherin、vimentin、snail表达WB图;A 正常组；B 模型组；C miR-126沉默组；D miR-126过表达组

3 讨论

增生性玻璃体视网膜病变是一种常见的孔源性视网膜脱离术后并发症，主要是指术后机体视网膜、玻璃体组织纤维增殖膜收缩导致视网膜再次脱离[9-11]。有研究表明，增生性玻璃体视网膜病变是一种由细胞外基质、细胞因子等因素参与的较为复杂的病理过程，因此手术治疗效果并不理想，许多专家学者开始致力于增生性玻璃体视网膜病变临床治疗的研究[12,13]。目前为止，临床医学尚未将增生性玻璃体视网膜病变的发病机制研究透彻，许多专家学者通过分子生物学、基础医学等途径对增生性玻璃体视网膜病变发病机制进行研究[14]。

微小RNA(miRNA)在大多数生物中大量存在，miRNA与机体炎性反应、免疫状态、微生物感染等多种病理学变化具有密切联系，miR-126为miRNA家族的组成成员，在视网膜病变中表达出现明显异常，但是关于调控miR-126表达对增生性玻璃体视网膜病变干预效果的研究还鲜有报道[15]。增生性玻璃体视网膜病变症状的发生发展与视网膜组织细胞增生、新生血管形成具有密切联系，VEGF是一种血管通透因子，在新生血管形成过程中发挥重要作用[16]。本文研究结果显示，与正常大鼠相比，增生性玻璃体视网膜病变大鼠miR-126表达较低，VEGF mRNA表达较高，过表达miR-126表达的增生性玻璃体视网膜病变大鼠miR-126表达上调，VEGF mRNA表达下调，出现这一研究结果的原因可能是上调miR-126表达能够靶向调控VEGF mRNA表达，抑制增生性玻璃体视网膜病变大鼠视网膜组织新生血管形成。

大量临床实验研究表明，视网膜病变的发生发展会对视网膜血流动力学水平造成严重的影响，检测视网膜血流动力学水平能够对视网膜病变严重程度、临床治疗效果进行评价[17,18]。本文研究结果显示，相比正常大鼠，增生性玻璃体视网膜病变大鼠Max、Min、TAMx水平明显下降，说明增生性玻璃体视网膜病变症状的发生发展伴随着血流动力学水平异常。本文研究还发现，过表达miR-126表达的增生性玻璃体视网膜病变大鼠Max、Min、TAMx水平明显上升，说明过表达miR-126能够起到改善增生性玻璃体视网膜病变大鼠视网膜组织血流动力学水平的作用。

增生性玻璃体视网膜病变症状的发生发展伴随着炎性反应。hs-CRP、IL-17、TGF-β1是临床常用的炎性因子，检测hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平变化能够对身体炎性反应严重程度变化情况进行评价。本文研究结果显示，相比正常大鼠，增生性玻璃体视网膜病变大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平较高，说明增生性玻璃体视网膜病变症状的发生发展伴随着炎性反应。本文研究还发现，过表达miR-126表达的增生性玻璃体视网膜病变大鼠hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平出现下降，说明过表达miR-126能够调控hs-CRP、IL-17、TGF-β1水平，从而起到抑制视网膜组织炎性反应的作用。

有研究表明，视网膜组织上皮细胞上皮-间充质转化与增生性玻璃体视网膜病变症状的发生发展具有密切联系[19-22]。E-cadherin、vimentin、snail是常用的上皮-间充质转化相关基因，三者表达的变化与机体组织细胞增殖、转移密切相关。本文研究结果显示，相比正常大鼠，增生性玻璃体视网膜病变大鼠E-cadherin表达较低，vimentin、snail表达较高，过表达miR-126表达的增生性玻璃体视网膜病变大鼠E-cadherin表达上调，vimentin、snail表达下调，出现这一研究结果的原因可能是增生性玻璃体视网膜病变伴随着视网膜上皮细胞上皮-间充质转化，过表达miR-126能够调控E-cadherin、vimentin、snail表达，阻断视网膜上皮细胞向肌成纤维细胞转化，从而发挥干预效果。

综上所述，上调增生性玻璃体视网膜病变大鼠miR-126表达，能够靶向调控VEGF mRNA，抑制大鼠视网膜新生血管形成，改善血流动力学水平，减轻炎性反应，阻断视网膜上皮细胞上皮-间充质转化，为增生性玻璃体视网膜病变的临床治疗提供参考依据。