IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宫肌瘤组织中的表达及相关性研究

姜艳婷 陈琳 李卓 高丹丹 张宁

子宫肌瘤属于一种在女性盆腔中较为常见的实体肿瘤，由子宫平滑肌细胞增生所致，在女性生育期间发生率较高，多发于>30岁的女性，子宫肌瘤发生后患者多存在较为明显的盆腔受压、月经紊乱增多、贫血、子宫异常出血、腰骶部疼痛、不孕、流产等症状，在一定程度上影响着患者的日常生活和生命安全[1,2]。目前临床上对于子宫肌瘤的发生机制尚不完全明确，但部分研究认为，此病的发生与多种细胞因子表达异常相关[3]。基于此，在本文研究中探究人含IQ基元GTP酶激活蛋白2(IQGAP2)、微小染色体维持蛋白7(MCM7)、硫酸基转移酶2A1(SULT2A1)、微小RNA-223(miRNA-223)在子宫肌瘤组织中的表达及相关性，为临床上子宫肌瘤的诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月至2020年1月我院收治的子宫肌瘤患者85例作为研究对象，年龄28～56岁，平均年龄(39.90±13.3)岁；月经正常34例，月经异常51例；肿瘤直径>5 cm 22例，肿瘤直径≤5 cm 63例；肌瘤数量：多发29例，单发56例；肌瘤部位：肌壁间26例，浆膜下30例，黏膜下29例；病理类型：平滑肌瘤37例，腺肌瘤48例。本次研究患者及家属均知情，签署了知情同意书，且经我院伦理委员会批准。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：所有患者经影像学和病理组织学确诊为子宫肌瘤。

1.2.2 排除标准：合并严重器官疾病者；近3个月内有类固醇激素用药史；合并肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤者；合并内分泌疾病者。

1.3 方法

1.3.1 样本采集:取所有患者手术切除的子宫肌瘤组织、瘤旁组织标本，其中50%组织样本采用40 g/L的多聚甲醛进行固定，并进行常规石蜡包埋，厚度为3 μm，连续切片作免疫组化标记；另外50%组织样本放置于液氮中冷冻，在温度为-80℃的冰箱中保存。

1.3.2 免疫组化:采用免疫组化检测IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宫肌瘤组织、瘤旁组织中表达，将石蜡切片标本放在二甲苯中脱蜡处理10 min，将二甲苯更换后再放置10 min，然后梯度乙醇水化；加入蛋白酶修复液，在37℃的恒温冰箱中孵化30 min，弃抗原修复液；切片移入湿盒中加入3%的H2O2后，采用去过氧化物酶封闭液进行密封，恒温冰箱孵育10 min，采用PBS冲洗；加入适量的山羊血清，在室温环境下封闭30 min；用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，然后再加入二抗，室温孵育1 h，采用PBS冲洗；经过DAB显色处理10 min，在显微镜下观察阳性反应，之后脱水并封片处理。每份标本在镜头下随机选择5个视野，所有病理切片由2位以上经验丰富的医师采用双盲法进行确诊。根据染色程度和染色细胞百分比进行评分：不着色0分，淡黄色1分，黄色2分，棕黄色3分；着色细胞数≤5%0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，≥51% 3分。阴性(-)得分≤1分，弱阳性(+)得分2～3分；中度阳性(++)得分4～5分；强阳性(+++)得分≥6分。

1.3.3 Western Blot法:采用Western Blot法检测IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宫肌瘤组织、瘤旁组织中的表达量，取液氮中冷冻的子宫肌瘤组织、瘤旁组织，10 000×g离心处理10 min，提取上清液，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100℃环境中加热5 min有助于蛋白发生变性。凝胶电泳完、转膜，取膜，4℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，将一抗使用0.05%～0.1% TBST给予稀释(IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223一抗为1∶1 000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.1% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.1% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理时间为5 min。DAB显色，定量分析蛋白表达情况。以GAPDH为内参。

2 结果

2.1 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宫肌瘤组织和瘤旁组织中的表达比较 与瘤旁组织比较，子宫肌瘤组织中IQGAP2、SULT2A1表达量显著降低，MCM7、miRNA-223表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1～4。

表1 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223在子宫肌瘤组织和瘤旁组织中的表达比较

子宫肌瘤组织 瘤旁组织

子宫肌瘤组织 瘤旁组织

2.2 IQGAP2、MCM7表达与子宫肌瘤患者临床特征的相关性分析 IQGAP2、MCM7表达与子宫肌瘤患者年龄、肌瘤数量、肌瘤部位无关，差异无统计学意义(P>0.05)；IQGAP2、MCM7表达与子宫肌瘤患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

子宫肌瘤组织 瘤旁组织

子宫肌瘤组织 瘤旁组织

表2 IQGAP2、MCM7表达与子宫肌瘤患者临床特征的相关性分析

2.3 SULT2A1、miRNA-223表达与子宫肌瘤患者临床特征的相关性分析 SULT2A1、miRNA-223表达与子宫肌瘤患者年龄、肌瘤数量、肌瘤部位无关(P>0.05)；SULT2A1、miRNA-223表达与子宫肌瘤患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，与月经正常、肌瘤直径≤5 cm、腺肌瘤患者比较，月经异常、肌瘤直径>5 cm、平滑肌瘤患者SULT2A1表达量显著降低，miRNA-223表达量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 SULT2A1、miRNA-223表达与子宫肌瘤患者临床特征的相关性分析

2.4 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223之间相关性分析 IQGAP2与MCM7呈负相关(r=-0.273,P=0.012)；IQGAP2与SULT2A1呈正相关(r=0.261,P=0.016)；IQGAP2与miRNA-223呈负相关(r=0.290,P=0.007)；MCM7与SULT2A1呈负相关(r=-0.344,P=0.001)；MCM7与miRNA-223呈正相关(r=0.342,P=0.001)；SULT2A1与miRNA-223呈负相关(r=-0.249,P=0.022)。见图5。

图5 IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223之间相关性分析

3 讨论

子宫肌瘤的发生属于多种因素共同作用的结果，目前对于此病的发生机制尚不完全明确，因此在此背景下，本文分析IQGAP2、MCM7、SULT2A1、miRNA-223与子宫肌瘤的相关性，为临床上此病的诊治提供参考。

含有IQ结构的GTP酶活化蛋白属于一类多位点支架蛋白，其包括IQ结构区、多聚脯氨酸结合区、钙调蛋白同源性结合区、Ras GTP酶活化蛋白相关结合区，上述区域通过与相应的蛋白结合，调节细胞凋亡、黏附、骨架、细胞因子等细胞转导通路，参与瘤的形成[4,5]。IQGAP2属于一种GTP酶活性蛋白，其分子量大约为180 KD，内含1 575个氨基酸，在人染色体5q13上所定位，属于IQGAP家族成员之一[6]。临床研究发现，IQGAP2在及活化血小板丝状伪足、胃腺细胞微观的膜处表达，其基因突变可促进多种恶性肿瘤的进展，包括胃癌、食管癌、肝癌等[7]。另外有研究显示，IQGAP2属于一种雌激素依赖抑癌基因，而临床上多认为子宫肌瘤是体内雌激素水平过高，长期受雌激素刺激所引发的疾病，因此有理由认为IQGAP2可能与子宫肌瘤的发生发展相关[8]。本文研究结果显示，IQGAP2在子宫肌瘤组织中呈现为低表达，且与患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，但目前临床上并未有研究认为IQGAP2与子宫肌瘤相关，因此本文研究结果还需研究进一步深入研究证实，为临床上子宫肌瘤的诊治提供新方向。

瘤的形成与细胞周期密切相关，而细胞周期与DNA复制相关，MCM属于一组与DNA复制和细胞增殖相关的蛋白家族，在DNA复制、基因组、染色体重构等过程中具有重要的调控作用[9]。临床研究发现，在细胞中MCM蛋白表现为周期性表达规律，在细胞处于G1/S转换时其表达量最高，在细胞处于G0期时其表达量最低，甚至不表达，因此临床上多采用MCM蛋白评价细胞增生状态[10]。MCM7属于MCM家族成员之一，在DNA复制起始过程的稳定维持中具有重要的作用，可保证一个周期中DNA复制仅有一次，其水平显著升高表示细胞增殖、增生显著[11]。目前已有研究显示，MCM7在多种恶性肿瘤组织中呈现为异常高表达，包括膀胱癌、非小细胞肺癌等，其水平升高在一定程度上促进了瘤细胞增殖，当其表达受到抑制后可抑制癌细胞增殖，抑制疾病进展[12]。张冬红等[13]在其研究中显示，MCM7在子宫肌瘤组织中呈现为高表达。基于前期研究，本文进一步验证MCM7在子宫肌瘤组织中的表达，结果显示，MCM7在子宫肌瘤组织中呈现为高表达，且与患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，临床上可根据其表达高低判断患者疾病程度。

目前随着临床上对于子宫肌瘤的深入研究发现，雌激素硫酸转移酶与子宫肌瘤的发生相关，SULTs超家族主要包括SULT1、SULT2两个亚族，其家族成员的主要作用为催化羟基类固醇硫酸化，包括孕烯醇酮、脱氢表酮、催化雄酮等[14]。SULT2A1属于SULT2家族成员之一，属于一种磷酸基团转移酶，主要参与某些外源性复合物的硫酸化转化和雌激素的无活性代谢过程，经修饰睾酮、雌激素受体，作用于雌激素，激活其下游通路，发生一系列的级联反应[15]。另外有研究显示，SULT2A1其含有多重丝氨酸结构，可经磷酸修饰平滑肌细胞膜上的糖蛋白，改变雌激素敏感性，就其对雌激素的调控作用而言，SULT2A1可能参与子宫肌瘤的发生发展[16]。本文研究结果显示，SULT2A1在子宫肌瘤组织中呈现为低表达，且与患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，临床上可根据其表达高低判断患者疾病程度。

miRNA属于一类内源性小RNA，其长度为18～24个核苷酸，在机体处于正常生理状态下时，miRNA具有严格的组织时序特异性，但在机体处于肿瘤环境下，miRNA出现异常表达，与抑癌基因的作用相关[17]。临床研究表明，miRNA与细胞增殖、分化、代谢、凋亡过程相关，与瘤的发生发展相关[18]。miRNA-223属于miRNA家族成员之一，有研究发现，miRNA-233与卵巢癌、子宫内膜癌等女性特发性肿瘤的发生发展相关[19]。目前笔者并未发现临床上有研究认为miRNA-233与子宫肌瘤的发生发展相关，本文研究结果显示，miRNA-223在子宫肌瘤组织中呈现为高表达，且与患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，此结果提示着，miRNA-223可能与子宫肌瘤患者疾病进展相关，可作为特异性诊断子宫肌瘤的指标。

综上所述，本文研究发现，IQGAP2、SULT2A1、MCM7、miRNA-223在子宫肌瘤组织中异常表达，与患者月经情况、肌瘤直径、病理类型相关，且四者之间具有一定的相关性，可能共同参与此病的发展，可用于临床上子宫肌瘤的诊断。