上调miR-34对口腔癌细胞增殖、凋亡能力及周期分布的影响

王康浴 王裕洲 陈海鹏 李国良 邓国磊

口腔癌是常见的恶性肿瘤，主要是发生于口腔上皮细胞，其中有80%属于鳞状上皮细胞癌，在全球常见肿瘤中居于第六位[1]。口腔癌的发病因素复杂，长期饮酒、吸烟、营养不良、口腔卫生差等都会可能引发口腔癌[2]。近年来我国口腔癌发病率呈上升趋势，由于口腔癌早期发病隐蔽无特异性表现，大部分患者确诊是已发展成中晚期[3]。目前口腔癌的五年生存期超过60%，早期诊断，早期治疗，对提高患者的生存质量和生存时间有重要意义[4,5]。本文研究中设计实验，通过上调miR-34细胞对口腔癌细胞进行实验，旨在探究上调miR-34对口腔癌细胞增殖、凋亡能力及周期分布的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 研究细胞：口腔癌细胞(中国医学科学院)。大鼠抗小鼠Bcl-2抗体(Sigma 公司)；免疫小鼠Bax抗体(BD公司)；小鼠抗大鼠caspase3抗体(Gibco公司)；免疫大鼠MMP-9、ICAM-1抗体(Hyclone公司)。本实验获医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:在40℃的环境中对冻存的口腔癌细胞进行火浴处理(40℃)，之后进行充分摇晃，将摇晃均匀的口腔癌细胞置于2 ml的培养基(10%PBS、1%双抗(青链霉素)RPMI-1640培养基500 ml)之内，之后使用2 000 r/min的离心机进行离心处理，进行重悬处理后将细胞传代，使用CO2培养箱对培养基培养24 h、换液，细胞融合率达90%后传代。

1.2.2 慢病毒载体构建及分组:miR-34基因序列根据质粒特点进行引物设计，引入SacⅠ酶切位点(由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)，miR-34下游序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3。GIT1上游序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3。正反链混合后加入退火缓冲液，96℃反应4 min，室温冷却，生成双链。使用Eco31Ⅰ酶切线性化质粒pGenesil-1，100倍稀释退火产物之后与其连接，20℃下水浴孵育过夜，使用大肠杆菌DH5α转化，第2d选择单克隆菌落，在30 μg/ml Kana的LB培养液中接种，2 000 r/min离心处理，37℃下震混，孵育过夜。少量抽提质粒后使用SacⅠ酶切进行鉴定(由宝生物工程(大连)有限公司完成)，分为空白组、上调miR-34组和下调miR-34组,重悬处理后分别加入4 μg 0.9%的氯化钠溶液、pcDNA3.1-miR-34、miR-34siRNA，电击处理后室温环境下存放120 min，将各组细胞加入6孔、96孔培养板中，置于培养箱内进行培养取出后加入含800 μg/ml G418的培养基再次培养。

1.2.3 细胞增殖检测:MTT法检测3组细胞增殖能力。将3组细胞加入96孔板中，分别于12、24、48、72 h 后再每孔中加入30 μl的MTT液，37℃孵育4 h，弃培养液，加入150 μl的DMSO，酶标仪在498波长处检测每孔的OD值。

1.2.4 TUNEL法检测细胞凋亡情况:常温环境中使用20 μg/ml蛋白酶K培养0.5 h后去除蛋白，使用PBS缓冲液进行彻底清洗，之后将平衡缓冲液100 μl加入其中，室温环境中平衡10 min，之后滴入TdT酶反应液100 μl，避光、室温环境中孵育1 h，之后加入100 μl SSC溶液，常温环境中静置20 min后进行清洗3次，之后使用DAPI进行复染，避光培养10 min后再次进行浸洗，封片观察。DAPI复染细胞核呈蓝色，凋亡细胞细胞核呈绿色，取每切片3视野进行观察、计算细胞凋亡率，计算平均值。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期分布：将3组细胞以1×105个细胞/孔接种于6孔板，并将其置于5% CO2、37℃环境中培养，之后添加0.25%胰蛋白酶进行消化，离心处理10 min，离心转通2 000 r/min，使用PBS缓冲液进行清洗，再次离心处理，之后添加1 ml PI染液，置于常温、避光环境60 min，进行特异荧光标记后按照流式细胞仪操作方法检测细胞周期分布。

1.2.6 细胞侵袭情况:使用Transwell小室实验检测。2 h前湿化小室。上室加入细胞悬液200 μl，在下室加入含10%胎牛血清的细胞培养液，在培养箱中培养24 h。用PBS冲洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。结晶紫染色15 min，染色后放在显微镜下观察计数。

1.2.7 细胞迁移情况:使用细胞划痕实验检测。将细胞使用胰酶消化制成细胞悬液，接种于6孔板。使用10枪尖垂直于孔板底部画直线，PBS缓冲液清洗 3次。常温培养24 h拍照计算划痕。

1.2.8 Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase3、E-cadherin、N-cadherin表达:使用PBS缓冲液对标本冲洗之后裂解30 min，测定蛋白浓度。取20 μg/孔蛋白质，添加蛋白缓冲液后进行电泳，10 min后将电转膜置于10%的牛奶中浸泡，常温环境下封闭90 min。之后结合一抗、稀释，孵育1 d，取出后使用TBST液冲洗，结合二抗，60 min后清洗、显色，对Bcl-2、Bax、caspase3、E-cadherin、N-cadherin相对表达量进行检测。

2 结果

2.1 3组细胞增殖率、凋亡率比较 在24、48、72 h，上调miR-34组细胞增殖率均低于空白组，凋亡率均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调miR-34组细胞增殖率均高于空白组、上调组，凋亡率均低于空白组、上调组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组细胞增殖率、凋亡率比较

2.2 3组细胞周期分布情况比较 上调miR-34组处在G1、S、G2期的细胞比例均低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；且下调miR-34组细胞比例均高于空白组、上调miR-34组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组细胞周期分布情况比较

2.3 3组细胞侵袭、迁移能力比较 上调miR-34组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数均低于于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；下调miR-34组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数均高于空白组、上调miR-34组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图1、2。

表3 3组细胞侵袭、迁移能力比较 个,

空白组 上调miR-34组 下调miR-34组

空白组 上调miR-34组 下调miR-34组

2.4 3组细胞Bcl-2、Bax、caspase3相对表达量比较 上调miR-34组细胞Bcl-2相对表达量低于空白组，Bax、caspase3相对表达量高于空白组，且下调miR-34组细胞Bcl-2相对表达量高于空白组、上调miR-34组，Bax、caspase3相对表达量均高于空白组、上调miR-34组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组细胞Bcl-2、Bax、caspase3相对表达量比较

2.5 3组细胞MMP-9、ICAM-1相对表达量比较 上调miR-34组细胞E-cadherin、N-cadherin相对表达量均低于空白组，且下调miR-34组细胞E-cadherin、N-cadherin相对表达量均高于空白组、上调miR-34组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 3组细胞E-cadherin、N-cadherin相对表达量比较

3 讨论

无限增殖、易转移是癌细胞的两大基本特征，抑制癌细胞增殖和转移是治疗癌症的关键[6]。近年来，随着对miRNA的不断认识，对癌细胞有抑制作用的miRNA越来越多[7]。有学者在研究中表示，miR-34可通过多种转录因子和靶基因来调控口腔癌细胞的增殖、侵袭和凋亡[8,9]。本文研究中通过上调miR-34对口腔癌细胞增殖、凋亡能力及周期分布进行研究。结果显示miR-34对口腔癌细胞有良好的抑制作用。

有学者在研究中表示，癌细胞的增值和凋亡失衡是肿瘤发生和发展的重要原因[10]。口腔癌癌细胞的增长率高于凋亡率，所以抑制口腔癌细胞的增殖、促进癌细胞凋亡对口腔癌的治疗有重大意义[11,12]。本文研究结果显示，上调miR-34的口腔癌细胞增殖率相对较低、凋亡率相对较高，这说明上调miR-34能够有效抑制口腔癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡，从而抑制口腔癌细胞的增殖与发展。

有学者在研究中表示，正常细胞中miR-34发挥促进细胞衰老、诱导细胞凋亡使细胞周期阻滞在G1期的作用[13]。本文研究结果显示，上调miR-34的口腔癌细胞在G1、S、G2期的细胞比例均较低，这说明上调miR-34表达量能够阻滞口腔癌细胞周期分布，从而抑制宫颈癌细胞的进一步发展。

有学者在研究中表示，癌细胞的侵袭和迁移是临床治疗失败的重要原因之一[14]。癌症患者约有80%是死于癌细胞的侵袭和迁移，所以控制癌细胞的侵袭和迁移，对治疗口腔癌有重要意义[15]。本文研究结果显示，上调miR-34的口腔癌细胞侵袭、迁移细胞数相对较少，说明上调miR-34表达表达量能够抑制口腔癌细胞的侵袭、迁移。

有学者在研究中表示，线粒体功能的变化是细胞凋亡的主要特征[16]。Bcl-2和Bax是线粒体通路中的核心蛋白，Bcl-2有调节线粒体通道的作用，Bax可通过升高线粒体膜通透性释放细胞色素C诱导癌细胞凋亡，caspase3可直接作为凋亡的效应分子，是细胞凋亡的关键蛋白，具有使细胞DNA片段化从而导致细胞凋亡的作用[17]。本文研究结果显示，上调miR-34后可使Bcl-2表达量下降，Bax、caspase3表达量上升。这说明上调miR-34可使促凋亡细胞上升，激活caspase3活性，促使癌细胞凋亡。

有学者在研究中表示，E-cadherin活性受抑制是促进癌细胞侵袭和转移的重要原因之一[17]。E-cadherin可通过稳定细胞间的连接来阻止癌细胞的侵蚀与转移[18]。N-cadherin可增强癌细胞与间质和内皮的粘附力，促进癌细胞的侵袭和转移[19]。本文研究结果显示，上调miR-34后N-cadherin表达量下降，E-cadherin表达量上升。这说明上调miR-34可调节E-cadherin、N-cadherin表达量，抑制口腔癌细胞的侵袭和转移。

综上所述，通过上调miR-34可促进口腔癌细胞凋亡、抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力，调控癌细胞周期分布，调节Bcl-2、Bax、caspase3、E-cadherin、N-cadherin相对表达量，为临床治疗口腔癌提供一定的参考依据。