miR-1271靶向MTDH基因调控子宫内膜癌细胞侵袭迁移的分子机制

王乾印 高文君 丁鑫

子宫内膜癌是女性生殖道系统常见的恶性肿瘤之一，近年的发病率呈升高趋势，严重威胁女性健康[1]。子宫内膜癌的异常增殖及恶化是其发生发展的主要原因之一，因此，寻找有效的子宫内膜癌治疗靶点具有重要意义。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类非编码的小分子RNA，长度为18～22nt，可在转录水平上调控相关基因表达，从而参与机体多种生命活动过程，其异常表达可促进肿瘤发生[2,3]。miR-1271定位于ARL10基因的第2个内含子区域，有研究显示，多种肿瘤中miR-1271可通过抑制不同的靶基因，从而抑制肿瘤细胞生长[4-6]。子宫内膜癌中miR-1271的研究较少，有研究显示，过表达miR-1271可通过靶向抑制CDK1降低子宫内膜癌细胞增殖及诱导细胞凋亡[7]，但miR-1271对子宫内膜癌细胞侵袭迁移的影响及机制尚未明确。异粘蛋白(Metadherin，MTDH)是近年发现的一个癌基因，多种肿瘤中MTDH呈高表达，其高表达可促进肿瘤进展[8,9]。有研究显示，MTDH在子宫内膜癌中表达升高，敲除MTDH可减弱肿瘤坏死因子-α相关凋亡诱导配体(TRAIL)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂LBH589联合治疗引起的肿瘤耐药性[10]。有研究显示，miR-1271可通过调控HDAC/Wnt信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖和侵袭能力[11]。本研究以人子宫内膜癌RL95-2细胞为研究对象，旨在miR-1271靶向调节MTDH对RL95-2细胞侵袭迁移的影响，并进一步研究其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人子宫内膜癌RL95-2细胞购自美国ATCC。DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Hyclone公司；miR-1271 mimics及对照miR-NC、miR-1271 inhibitor及对照anti-miR-NC、MTDH siRNA及阴性对照均购自上海吉玛制药技术有限公司；LipofectamineTM 2000试剂盒、Trizol试剂均购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；Transwell小室购自美国Coming公司；E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗体均购自美国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒购自中国碧云天生物；ECL发光液购自美国Santa cruz公司；荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；PCR仪购自美国Thermo公司。

1.2 细胞培养 RL95-2细胞使用含有10 %胎牛血清的新鲜的DMEM培养基，放置于5%体积分数CO2、37℃恒温恒湿培养箱培养，细胞呈现贴壁增殖，细胞达80%～90%生长融合度时，胰酶消化、传代，取生长至对数期的细胞用于实验研究。

1.3 细胞转染 取生长状态良好的RL95-2细胞，以5×105个/孔均匀的接种于6孔板中，每孔2 ml，使用无血清培养基培养，细胞覆盖达到80 %时即可进行转染。转染参照LipofactmineTM 2000说明，使用无血清培养基分别稀释miR-1271 mimics(miR-1271组)及对照miR-NC、miR-1271 inhibitor(anti-miR-1271组)及对照anti-miR-NC、MTDH siRNA(si-MTDH组)及阴性对照(si-NC组)和si-MTDH+anti-miR-1271作为A液，使用无血清培养基稀释Lipofactmine 2000作为B液。混匀A液和B液，室温孵育20 min。将混合液加入6孔板中，培养箱中常规孵育6 h。更换为含血清的DMEM培养基，继续培养48 h，用于后续实验。

1.4 qRT-PCR检测miR-1271基因表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA含量，取1 mg/ml总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板进行PCR反应，反应体系20 μl，其中cDNA 2 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，2×SYBR Green PCR Master mix 10 μl，加ddH2O定容至20 μl。反应条件95℃预变性1 min；(95℃变性15 s；60℃退火1 min)循环40次。PCR引物由上海生工合成，引物序列：miR-1271 F 5’-CAGCACTTGGCACCTAGCA-3’,R 5’-TATGGTTGTTCTCCTCTCTGTCTC-3’；内参U6 F 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,R 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。以U6作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-1271基因相对表达量。设置5个复孔，实验重复3次。

1.5 Transwell小室检测细胞侵袭和迁移 细胞侵袭检测时Transwell小室的聚碳酸脂膜上需铺Matrigel基质胶，细胞迁移检测不需铺Matrigel基质胶，其他操作步骤一致。使用无血清培养基稀释Matrigel，将稀释后的Matrigel铺在Transwell小室的聚碳酸脂膜上，将小室放入24孔板内，5%体积分数CO2、37℃培养箱孵育30 min，基质胶凝固后，吸除残留液体。胰酶消化各组细胞，制备成单细胞悬液，并调整细胞浓度为1×105个/100 μl。上室中每孔加100 μl单细胞悬液，下室中每孔加500 μl含血清的培养基，于培养箱常规孵育24 h。取出小室，棉签轻轻擦掉基质胶及上室细胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.1%结晶紫染色1 min。高倍显微镜下随机选择5个视野(上、中、下、左、右)，计数穿膜细胞数。每种处理设置3个复孔，实验重复3次。

1.6 Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达 收集各处理组细胞沉淀，加入适量RIPA细胞裂解液，在冰上反应30 min，离心，收集上清。BCA法定量蛋白。上清液与5×上样缓冲液混匀，100℃变性5 min。取等量变性蛋白上样，经SDS-PAGE电泳、转移至PVDF膜后，使用5%的脱脂奶粉封闭膜2 h，加入1∶1 000稀释的一抗溶液(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin抗体)，4℃孵育过夜。TBST洗膜，加入1∶2 000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，室温孵育2 h，洗膜。加入ECL，暗室中用X线胶片曝光，常规显影、定影。Quantity One软件分析条带灰度值。实验重复3次。

1.7 双荧光素酶报告基因实验 在线生物信息学软件显示miR-1271和MTDH存在结合位点。构建MTDH 3’UTR野生型(WT)及突变型(MUT)载体，并插入pMIR-REPORT miRNA Expression Reporter载体中产生WT/MUT-MTDH-3’UTR质粒。使用LipofactmineTM2000将WT/MUT-MTDH-3’UTR质粒分别与miR-1271 mimics和miR-NC共转染至RL95-2细胞。转染48 h，使用双荧光素酶报告基因检测系统测定荧光素酶活性。

2 结果

2.1 上调miR-1271表达可抑制RL95-2细胞侵袭和迁移 miR-1271 mimics转染RL95-2细胞48 h，qRT-PCR结果显示，miR-1271组miR-1271基因表达明显高于miR-NC组(P<0.05)。Transwell小室结果显示，miR-1271组细胞侵袭和迁移数均明显低于miR-NC组(P<0.05)。见表1。

表1 上调miR-1271表达对RL95-2细胞侵袭和迁移的影响

2.2 上调miR-1271表达对RL95-2细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响 Western blotting检测侵袭迁移相关E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达，结果显示，与miR-NC组比较，miR-1271组E-cadherin表达明显升高，N-cadherin和Vimentin表达明显降低(P<0.05)。见图1，表2。

图1 上调miR-1271表达对RL95-2细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响

表2 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白相对表达量

2.3 miR-1271靶向下调MTDH表达 靶基因预测软件显示miR-1271与MTDH有相互作用的位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-1271 mimcis与MTDH野生型共转染后荧光素酶活性明显降低(P<0.05)，而与MTDH突变型共转染后荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。Western blotting检测结果，转染miR-1271 mimics的RL95-2细胞MTDH表达明显降低，转染miR-1271 inhibitor的细胞MTDH表达明显升高(P<0.05)。提示miR-1271和MTDH存在靶向关系，miR-1271可负调控MTDH表达。见图2，表3。

图2 miR-1271和MTDH的结合位点及转染miR-1271 mimics/inhibitor的细胞MTDH表达

表3 2组细胞双荧光素酶活性

2.4 miR-1271通过下调MTDH抑制RL95-2细胞侵袭迁移 RL95-2细胞转染MTDH siRNA后，与si-NC组比较，MTDH表达明显降低，细胞侵袭和迁移数明显降低(P<0.05)。MTDH siRNA与anti-miR-NC共转染后，与si-MTDH组比较，MTDH表达及细胞侵袭和迁移数差异均无统计学意义(P>0.05)。MTDH siRNA与miR-1271 inhibitor共转染同时抑制MTDH和miR-1271表达，与si-MTDH+anti-miR-NC组比较，MTDH表达明显升高，细胞侵袭和迁移数明显升高(P<0.05)。见图3，表4。

表4 miR-1271靶向调节MTDH对RL95-2细胞侵袭迁移的影响

图3 Western blotting检测各转染组细胞MTDH表达

2.5 miR-1271通过下调MTDH抑制RL95-2细胞EMT 抑制RL95-2细胞MTDH或同时抑制MTDH和miR-1271表达后，Western blotting检测E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达，结果显示，与si-NC组比较，si-MTDH组 E-cadherin表达明显升高，N-cadherin和Vimentin表达明显降低(P<0.05)。与si-MTDH+anti-miR-NC组比较，si-MTDH+anti-miR-1271组E-cadherin表达明显降低，N-cadherin和Vimentin表达明显升高(P<0.05)。见图4，表5。

图4 miR-1271靶向MTDH对RL95-2细胞E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响

表5 4组细胞 E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的蛋白相对表达量

3 讨论

miRNAs是一类单链RNA分子，在生物体中广泛存在，可通过与靶mRNA的3’UTR结合调节转录后的mRNA，降低mRNA或抑制其翻译，从而参与细胞增殖、侵袭迁移、凋亡等过程[12]。越来越多研究表明，miRNAs可通过靶向下游的促癌或抑癌基因，进而促进或抑制子宫内膜癌细胞生长[13]。miR-1271是miRNAs家族新成员，在多种肿瘤中有独特作用，受到研究者广泛关注。有研究显示，miR-1271可通过靶向HOXA5促进非小细胞肺癌增殖和侵袭[14]；miR-1271可靶向抑制DIXDC1降低前列腺癌细胞增殖和侵袭[15]；miR-1271可通过靶向ALK抑制口腔鳞癌细胞生长和转移[16]。本研究将miR-1271 mimics转染子宫内膜癌RL95-2细胞，miR-1271基因表达明显升高，细胞侵袭能力明显降低，E-cadherin表达明显升高，N-cadherin和Vimentin表达明显降低。肿瘤细胞上皮间质转化(EMT)与侵袭转移行为密切相关，EMT可导致上皮细胞失去极性，细胞间粘连降低，细胞获得侵袭和迁移能力[17]。在EMT过程中，上皮标志物E-cadherin表达降低，间质标志物Vimentin、N-cadherin等表达增加。有研究显示，miR-1271可通过靶向ZEB1和TWIST1 抑制胰腺癌细胞侵袭迁移和EMT[18]；miR-1271可通过靶向Emodin抑制胰腺癌细胞侵袭及EMT[19]。本研究结果提示上调miR-1271表达可抑制子宫内膜癌细胞侵袭迁移，机制可能与抑制EMT有关，这与在其他肿瘤研究结果一致。

本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实MTDH是miR-1271的靶基因。通过使用miR-1271 mimics/inhibitor证实MTDH表达受miR-1271调控，进一步证实miR-1271和MTDH存在靶向关系。抑制MTDH表达可降低RL95-2细胞侵袭迁移，上调E-cadherin表达，下调N-cadherin和Vimentin表达，而将miR-1271 inhibitor与MTDH siRNA共转染至RL95-2细胞，发现抑制miR-1271表达可减弱抑制MTDH表达对RL95-2细胞侵袭迁移及E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达的影响。MTDH是肿瘤恶化的一个关键分子，可促进肿瘤侵袭转移、血管生长等多种生物学行为[20]。最近多项研究表明，miRNA-MTDH调控轴可影响肿瘤细胞生长。王淑芬等[21]研究显示，miR-26a可通过调节MTDH抑制卵巢癌细胞增殖；Zhang等[22]研究显示，miR-217可通过靶向MTDH抑制肝癌细胞增殖、侵袭迁移及促进细胞凋亡；Qi等[23]研究显示，miR-145和miR-497 可通过靶向MTDH抑制TGF-β诱导的非小细胞肺癌EMT。本研究结果提示miR-1271可通过靶向MTDH基因抑制子宫内膜癌细胞侵袭迁移及EMT。

综上所述，过表达miR-1271及抑制MTDH表达均可降低子宫内膜癌细胞侵袭和迁移能力，miR-1271可通过靶向MTDH抑制子宫内膜癌细胞侵袭迁移和EMT。miR-1271和MTDH可能是子宫内膜癌诊疗的潜在标志物，miR-1271/MTDH分子轴可能是子宫内膜癌治疗的一个新思路。