程序性细胞死亡的分子机制及其与干性年龄相关性黄斑变性的关系△

利虹瑛 李 艳 张梦圆 姚 勇 蔡季平 谢田华 邵 珺

年龄相关性黄斑变性 (AMD) 是一种视网膜黄斑区结构的衰老性病变。Bruch 膜增厚、玻璃膜疣形成、视网膜色素上皮 (RPE) 细胞和感光细胞损伤、脉络膜新生血管是AMD的主要病理特征[1]。AMD分为干性和湿性，目前临床上对湿性AMD的治疗已取得巨大进展，如抗血管内皮生长因子、光动力疗法等，但对于干性AMD仍无有效治疗方法。RPE细胞死亡在干性AMD疾病发展中起着关键调控作用。程序性细胞死亡是一类由特定基因介导并调控的细胞死亡过程，在人体生长发育、疾病调节中起着重要作用[2]。程序性细胞死亡主要有凋亡、自噬、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡5种形式。本文就近年来5种程序性细胞死亡在干性AMD中的研究进展作一综述，为干性AMD的发病机制研究及治疗提供新思路。

1 AMD临床现状及发病机制

AMD是导致全球老年人失明的主要原因。据报道，2020年全球AMD的患者约达1.96亿人，预计到2040年将增加到2.88亿人[3]。除了衰老这一主要因素外，AMD的病因还包括遗传、性别、种族、饮食、吸烟、慢性光损伤、体重指数、高血压、脉络膜血管功能不全等[4]。AMD的临床症状主要表现为进行性中心视力急剧下降，病情呈不可逆性进展。根据有无脉络膜新生血管，可分为干性和湿性两大类。湿性AMD的临床表现更为严重，但干性AMD发病率更高，且晚期干性AMD有可能进一步发展为湿性。干性AMD患者RPE细胞受损后其吞噬功能下降，Bruch 膜增厚，玻璃膜疣形成，诱发炎症反应，进一步导致RPE细胞死亡及脉络膜毛细血管萎缩[5]。程序性细胞死亡导致的RPE细胞死亡在干性AMD的发病机制中起到一定的作用，其背后的潜在机制仍未完全被人们了解。

2 程序性细胞死亡的分子机制

程序性细胞死亡广泛参与多种疾病的病理生理过程，其分子机制经常被用作疾病的治疗靶点。除了经典的凋亡和自噬外，新的程序性细胞死亡形式包括坏死性凋亡、焦亡和铁死亡。表1主要从形态学特征、生化特征、有无炎症反应和核心靶点四个方面对5种程序性细胞死亡特征进行了比较。

表1 5种程序性细胞死亡特征的比较

3 程序性细胞死亡与干性AMD的关系

3.1 细胞凋亡与干性AMD细胞凋亡是机体通过调控相关基因的表达激活或抑制细胞自主死亡的过程。凋亡的启动依赖于caspase家族的激活。在外来信号刺激下，起始 caspase (caspase-8、caspase-9) 激活，进而激活执行 caspase (caspase-3、caspase-6、caspase-7) ,引发下游连锁反应，诱发凋亡。细胞活力测定、免疫印迹凋亡关键蛋白评价、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记等是细胞凋亡的常用检测方法[6]。

随着年龄的增长，线粒体功能障碍会诱导RPE细胞凋亡，加速干性AMD的发病。研究发现，AMD患者RPE细胞中凋亡阳性细胞数增多且 caspase-3 表达上调[7]。Z-VAD-FMK (Pan caspase抑制剂)、Z-IETD-FMK(caspase-8抑制剂)或Z-ATAD-FMK(caspase-12抑制剂)等凋亡抑制剂能够逆转7-酮胆固醇(一种脂蛋白沉积氧化产物)诱导的RPE细胞凋亡[8]。β-淀粉样蛋白(玻璃膜疣的主要成分)通过激活糖基化终末产物受体/核因子κB(NF-κB)信号通路，激活 caspase-3，诱导RPE细胞凋亡[9]。蒺藜醇[10]、白皮杉醇[11]通过激活 PI3K/Akt-Nrf2 信号通路，以Nrf2作为转录因子，诱导抗氧化基因 (HO-1、NQO1、GCLC、SOD1) 表达，降低氧化应激诱导的RPE细胞凋亡。异染色质通过抑制 P53 介导的RPE凋亡，缓解AMD病情[12]。Krüppel样转录因子4通过激活白细胞介素-17受体A介导的炎症反应，诱导RPE细胞凋亡[13]。miRNA是一类非编码RNA，在许多疾病过程中起着不可或缺的作用。Liu 等[14]发现，miR-21-3p可负性调控G蛋白信号调节因子4诱导的 caspase-3 活性，促进RPE细胞凋亡。miR-144 通过直接靶向作用于Nrf2，促进Nrf2降解，抑制Nrf2介导的抗凋亡作用[15]；同样，miR-626通过靶向kelch样 ECH 关联蛋白1，抑制其与Nrf2结合，促进Nrf2入核，激活Nrf2介导的抗凋亡作用[16]。miR-374a 则通过靶向 FasL/Fas 通路抑制 caspase-3 激活[17]。由此可见，细胞凋亡与干性AMD关系密切，它在干性AMD的预防和治疗中的作用有待进一步研究。

3.2 细胞自噬与干性AMD细胞自噬是一种广泛存在的溶酶体依赖的细胞内降解过程，主要分为巨自噬、微自噬和伴侣介导的自噬。自噬的经典过程可以概括为：(1)引发/成核；(2)延伸；(3)成熟；(4)融合和降解。多种蛋白参与了这一过程，包括自噬相关蛋白、自噬基因Beclin-1、p62蛋白、mTOR、微管相关蛋白轻链3[18]。

在干性AMD的发展中，视网膜组织不断产生视黄醛、脂褐素、受损蛋白质、玻璃膜疣等毒性细胞代谢物，自噬能有效地清除RPE细胞中的细胞代谢物，缓解AMD的进展[19]。RPE细胞自噬功能障碍在AMD的发展中起着关键作用。研究发现，AMD患者RPE细胞的自噬流水平显著降低[20]。自噬核心基因 ATG5 和 ATG7 敲除小鼠可呈现AMD样表型，表现为RPE细胞增厚、肥大(或营养不良)、色素异常、氧化蛋白积聚等[21]。自噬激动剂雷帕霉素能够通过激活自噬，诱导清除受损线粒体，缓解AMD进一步发展[22]。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(或敲除 Beclin-1)通过抑制自噬增加了线粒体氧化应激，诱导脂褐素沉积，诱发RPE细胞凋亡[23]。研究发现，二甲双胍(AMP 依赖的蛋白激酶激动剂)通过激活 AMP 依赖的蛋白激酶/mTOR信号通路，激活自噬从而缓解RPE细胞凋亡[24]。RS9(Nrf2 激动剂)可通过激活AMP依赖的蛋白激酶/mTOR 通路促进自噬，进而激活 P62/Nrf2维持RPE细胞的功能[25]。趋化因子受体5通过 PI3K/AKT 信号通路，抑制转录因子 FOXO1 的激活，从而调节RPE细胞的稳态和自噬调控相关基因的表达[26]。miR-29在RPE细胞中过表达会导致p62降低、微管相关蛋白轻链3脂质形式增加、自噬通量增加。此外，miR-29 通过靶向信使 RNA 的 3’-UTRs 转录后进一步抑制mTORC1的活性，诱导细胞自噬[27]。NF-κB 激活可诱导 miR-24 表达降低，进而激活AKT/mTOR信号通路抑制自噬,诱导RPE细胞功能障碍[28]。以上研究均表明，自噬对RPE细胞起着重要的保护作用，自噬功能障碍可能会加剧氧化应激并导致干性AMD的发病，它可作为新的治疗靶点。

3.3 细胞坏死性凋亡与干性AMD细胞坏死性凋亡是当正常凋亡途径被抑制时发生的一种替代性程序性细胞死亡。它主要由RIPK1、 RIPK3和混合谱系激酶结构域样假激酶调节。RIPK1/ RIPK3介导后者的磷酸化，启动下游信号，诱导细胞坏死性凋亡[29]。

在AMD患者和小鼠中均能观察到细胞肿胀、空泡等细胞坏死性凋亡的特征。在氧化应激作用下，RPE细胞可检测到细胞膜通透性降低、RIPK1 和 RIPK3 激活、细胞核高迁移率族蛋白1释放[30]。dsRNA(玻璃膜疣的一种成分)能够诱导视网膜坏死和炎症反应，而敲除 RIPK3 能够降低细胞核高迁移率族蛋白1、肿瘤坏死因子-ɑ、IL-6 等炎症因子含量，缓解视网膜坏死和炎症反应[31]。在不同AMD动物模型中，RIPK1 抑制剂能保护RPE细胞免受坏死性凋亡的影响，维持了视网膜的视觉功能[32]，且具有良好的角膜渗透性，是临床干性AMD治疗候选药物之一。4-乙酰氧基苯酚通过抑制 RIPK3 的激活，稳定Nrf2，上调 NQO1 和 HO-1 抗氧化基因表达，保护RPE细胞，避免发生氧化应激所致的细胞坏死[33]。β-淀粉样蛋白可以通过激活 Toll 样受体4 (TLR4) /NF-κB 信号通路,诱导 IL-6、IL-8 和 IL-33 等炎症因子的表达，介导RPE细胞坏死性凋亡；COBRA (TLR4 抑制剂)可逆转以上现象[34]。Klettner 等[35]研究发现，TLR3、TLR4 激动剂和肿瘤坏死因子-ɑ 均能够诱导RPE细胞分泌 IL-6 和 IL-8，降低RPE细胞活性和细胞功能，导致视网膜萎缩变性。以上研究均证实了细胞坏死性凋亡在干性AMD发病过程中起到关键性作用。

3.4 细胞焦亡与干性AMD细胞焦亡(也称炎性坏死)是一种依赖于 Gasdermin 蛋白家族膜打孔功能的裂解性程序性细胞死亡，通常与 caspase 激活有关。细胞焦亡可由不同的炎症小体介导，目前对NLRP3 研究最为广泛。NLRP3 炎症小体由 NLRP3、凋亡相关微粒蛋白和活化的 caspase-1 组成[36]。激活 NLRP3炎症小体后，以蛋白水解的方式切割炎症因子前体，如 IL-1β、IL-18、Gasdermin D 等，会诱发细胞焦亡。

2012年，人们首次研究发现，NLRP3 与AMD相关[37]，从AMD患者眼球中分离出的玻璃膜疣成分可激活外周髓细胞和单核细胞中的 NLRP3 炎症小体和 caspase-1,进而促进 IL-1β 和 IL-18 的分泌。选择性的 NLRP3 抑制剂 (IFM-514、IFM-632 和 CRID3) 可显著抑制RPE细胞焦亡以及氧化损伤[38]。caspase-1 敲除小鼠视网膜炎症反应减少、光感受器细胞存活率升高、视网膜功能得到更好的保护[39]。Kerur等[40]研究发现，干性AMD患者和小鼠模型中可以检测到 caspase-4、Gasdermin D 等含量升高。氧化型低密度脂蛋白能够诱导RPE细胞 NLRP3、 caspase-1 和 IL-1β 的表达增加，而 INF39 (NLRP3 抑制剂) 能逆转其诱导的细胞焦亡[41]。光氧化刺激RPE细胞可以促进外泌体分泌，并通过上调 NLRP3、IL-1β、IL-18 和 caspase-1 的表达加重细胞的氧化损伤以及焦亡[42]。microRNA-22-3p 通过直接靶向结合NLRP3，抑制 NLRP3 诱导的细胞焦亡，缓解AMD病程[43]。拉米夫定(核苷类似物逆转录酶抑制剂)通过抑制 NLRP3，显著降低 RNA 诱导的人和小鼠RPE细胞 IL-18、IL-1β 和 p16 的表达，缓解RPE细胞衰老[44]。β-淀粉样蛋白可以诱导RPE细胞产生肿胀、起泡、膜破裂等焦亡形态学特征，且伴随着 IL-1β、IL-18 等细胞焦亡表型指标增加，其机制可能通过激活 NLRP3/caspase-1/GSDMD-N 信号通路诱导细胞焦亡；枸杞多糖则可通过抑制β-淀粉样蛋白诱导的细胞焦亡缓解RPE细胞功能障碍[45]。Gao等[46]研究发现，当细胞焦亡被激活时，X-连锁凋亡抑制蛋白表达下调，其可能通过抑制 caspase-1/IL-1β/IL-18 信号通路抑制RPE细胞焦亡。花青素-3-葡萄糖苷[47]通过抑制 c-Jun氨基末端激酶/活化蛋白-1信号通路，抑制NLRP3、IL-1、IL-18 和 caspase-1 相关细胞焦亡基因的表达，从而减轻RPE细胞焦亡。以上体内外研究均证实，细胞焦亡在AMD的发病机制中起着重要作用，抑制细胞焦亡可能成为治疗或延缓AMD的新途径。

3.5 细胞铁死亡与干性AMD细胞铁死亡是以铁离子诱导的膜脂质过氧化为特征的程序性细胞死亡。在二价铁和脂氧合酶的作用下，催化细胞膜上高表达的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化；同时由于膜脂修复酶GPx4失效，诱导细胞死亡[48]。其生物学特征主要为Fe2+浓度升高，GPx4 失活和谷胱甘肽浓度降低。

Hahn 等[49]研究发现，AMD患者视网膜中总铁含量高于同龄健康人，铁诱导生成的氧自由基参与AMD中RPE细胞的损伤过程。谷胱甘肽是RPE细胞中重要的抗氧化剂，AMD患者视网膜中谷胱甘肽含量显著降低，并且伴随着GPx4活性降低。RPE细胞中谷胱甘肽含量下降能够诱导细胞铁死亡、自噬和衰老，而给予铁死亡抑制剂去铁胺(抑制Fe2+)、铁抑素-1(抑制脂质过氧化)或补充谷胱甘肽能逆转以上现象，说明铁死亡在AMD疾病进展中的重要性[50]。AMD患者视网膜中视黄醛含量显著升高，过量视黄醛可诱导光感受器细胞中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4表达升高，并可抑制溶质载体家族7成员11，诱导细胞内半胱氨酸含量降低，抑制谷胱甘肽合成，促进脂质过氧化，共同加速细胞铁死亡[51]。硒蛋氨酸通过激活Nrf2进而诱导其靶基因溶质载体家族7成员11的表达[52]，增加细胞内半胱氨酸的含量，增加谷胱甘肽合成，增强RPE细胞的抗氧化能力，缓解铁死亡。黄芪甲苷作为一种潜在的视网膜保护剂，可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶和 NF-κB 信号通路，进而抑制RPE细胞中铁离子调节相关蛋白的表达，降低细胞内 Fe2+含量，抑制细胞铁死亡[53]。因此，抑制铁死亡可以作为治疗干性AMD的新靶点。

4 总结与展望

RPE细胞发生程序性细胞死亡在干性AMD的病程发展中起着重要作用。凋亡、自噬、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡这5种程序性细胞死亡有可能成为治疗干性AMD的新靶点。进一步深入研究程序性细胞死亡与干性AMD的发病机制的关系至关重要，可为临床AMD的早期诊断和治疗提供理论依据。