HBsAg与HBsAb双阳性慢性乙肝患者Pre-S/S区基因突变研究

王海坚，林建萍，郑霜，邵伟，李超，童郁，戴显宁

（温州市人民医院，浙江 温州 325000）

每年约有65万人死于乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染所致的终末期肝脏疾病[1]。目前己发现的 HBV 有 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 10 种基因型，中国以B和C基因型常见[2]，HBV基因型与疾病进展、治疗和预后密切相关[3]。

通常情况下，乙肝表面抗体（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）会在机体清除乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）6 周-6 个月出现，是机体对抗HBV产生免疫力的标志。在临床实践中偶尔会遇到HBsAb和HBsAg双阳性，国内外学者对其发生机制与临床意义仍有争论[4]。HBV“a”决定簇内的碱基突变已被证实可显著改变HBsAg结构和抗原性[5]，从而影响HBsAb与HBsAg的结合，由野生型刺激产生的抗体对变异的HBsAg结合能力削弱，HBsAb无法完全中和体内存在的HBsAg，从而产生变异的HBsAg和野生的HBsAb两者共存的现象[6]。本文通过对HBsAg与HBsAb双阳性样本的Pre-S1、Pre-S2及S区进行测序，探索出现HBsAg与HBsAb双阳性的血清型模式与HBV S区与Pre-S1/S2基因突变的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择本院2018年3月-2020年3月HBsAg/HBsAb双阳性慢性乙肝患者64例（双阳组），其中男 38 例，女 26 例，平均（40.6±12.4）岁，选择同期HBsAg+/HBsAb-的慢性乙肝患者72例（对照组），其中男 42 例，女 30 例，平均（38.5±9.9）岁。两组均符合《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准[7]，且无合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎，并排除由其他原因引起的肝病，如药物性肝病、自身免疫性肝病、酒精性肝炎等。本研究经本院伦理委员会审核通过且患者知情同意。

1.2 方法 HBV-DNA采用荧光定量PCR（陕西天隆试剂，最低检测线30-100拷贝）检测；乙肝病毒Pre-S/S区扩增使用引物及测序均由杭州擎科梓熙生物技术有限公司提供，通过巢氏PCR进行扩增。 （1）Pre-S1/S2 区引物： 第一轮：Pre-S1 F2814：GGGTCACCATATTCTTGGG，Pre-S1 R1006：GACCCACAATTCTTTGACAT；扩增条件：95℃ 3分钟，95℃ 15 秒、53℃ 30 秒、72℃ 1 分钟 30 个循环，72℃10 分钟。 第二轮：Pre-S2 F2825：TTCTTGGGAACAAGAGCTAC； Pre-S2 R273： TTGAGAGAAGTCCACCACGA。扩增条件：95℃3分钟，95℃15秒、54℃30秒、72℃1分钟 30个循环，72℃10分钟。 （2）S区引物：第一轮：Pre-S1F2818：CACCATATTCTTGGGAACAAG；Pre-S1R1428：GTAAACAAAGGACGTCCCGC；扩增条件：95℃ 3 分钟、95℃ 30 秒、55℃ 30 秒、72℃ 2分钟30个循环，72℃10分钟。第二轮：Pre-S2 F56：CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC； Pre-S2 R1113：CTTG TAAGTTGGCGAGAAAGT。扩增条件：95℃3分钟、95℃ 30 秒、58℃30 秒、72℃1 分钟 30 个循环，72℃10分钟。

1.3 评价标准 通过对HBsAg与HBsAb双阳性样本的 Pre-S1、Pre-S2及 S区进行测序，通过（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）进行HBV分型，确认感染基因型。使用SnapGene4.3.6观察峰形图，与对应基因型的参考序列（B 基因型：AF100309.1、D00329.1、KC774377.1、AB602818.1；C 基 因 型 ：AB033556.1、AB014381.1、X04615.1、AF533983.1）进行比对分析，探讨出现HBsAg与HBsAb双阳性的血清型模式与HBV S区、Pre-S1/S2基因突变的关联。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行数据处理。计量资料用（±s）表示，正态分布的数据两组间比较采用独立样本t检验，非正态分布的资料采用Wilcoxon秩和检验；计数资料用百分率标志，并采用χ2检验。

2 结果

2.1 血清亚型比较 双阳组、对照组B基因型的乙型肝炎病毒血清亚型均以adw2亚型为主，C基因型均以adrq+为主。两组血清亚型差异无统计学意义（χ2=0.068、χ2=1.929，P＞0.05）。详见表 1。

表1 两组血清亚型比较（n）

2.2 S区、Pre-S1区、Pre-S2区突变率比较 （1）图1可知，双阳组S区中最易发生氨基酸突变的位点为T47、I126、T131，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），两组 V14、F41、A45、S58、F161、M133、V224 位点差异有统计学意义（P＜0.05）。 （2）HBsAg与HBsAb共存可能与 S区 N端（aa1-99）、C端（aa170-226）、“a”决定簇第一环（aa124-137）碱基突变相关（P＜0.05 或 P＜0.01）（表 2），且发现双阳组有7例标本发生无义突变，突变率为10.9%（χ2=6.213，P＜0.05）。Pre-S1 区、Pre-S2 区氨基酸突变差异无统计学意义（P＞0.05），但双阳组6例碱基大片段缺失，突变率 10.3%（χ2=5.104，P＜0.05），而对照组均无此类现象发生。双阳组的杂合突变率54.4%（35/64）也显著高于对照组的 27.8%（20/72），差异有统计学意义（χ2=10.186，P＜0.01）。 （3）对比相同基因型双阳组与对照组氨基酸序列后发现，两组B基因型氨基酸突变率差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2），两组 C 基因型在 N 端、“a”决定簇第一环、C端差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表3。

表2 两组S区、Pre-S1、Pre-S2突变率比较

表3 相同基因型S基因、Pre-S1基因、Pre-S2基因氨基酸残基突变率比较

图1 S 区氨基酸突变率分布图（*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

乙型肝炎病毒感染是一个威胁人类健康的全球性公共卫生问题，由于其“易突变”的特性，导致国内外学者对于乙肝病毒突变分析越来越重视。

本研究发现，双阳组和对照组B基因型和C型基因差异无统计学意义（χ2=3.491，P＞0.05），未发现A、D、E等其他基因型的存在。有报道表明，C基因型比B基因型更容易出现肝脏疾病的发展和恶化，意味着HBV感染后HBsAg与HBsAb双阳性现象的出现使进展为终末期肝病的风险提高[8]。

表2 提示，双阳组的 S 区 N 端（aa1-99）、“a”决定簇的第一环（aa124-137）、C 端（aa170-226）均具有更高的突变率。据报道，S区基因的突变尤其是“a”决定簇的突变导致HBsAg抗原性发生改变，产生HBsAg与HBsAb共存的现象[9]，但进行基因型分组对比后却发现，在B基因型中，双阳组与对照组无论是在S区、Pre-S1、Pre-S2区差异均无统计学意义，而C基因型在N端、“a”决定簇第一环、C端、Pre-S2区差异有统计学意义。Lin等[10]研究表明，HBsAg和HBsAb双阳性组较单纯HBsAg阳性组有更高的“a”决定簇内点突变率，且C基因型具有更高的“a”决定簇突变率，B基因型差异无统计学意义，这都与本研究结论相似。此外，免疫应答细胞和抗体通过定位这个区域识别HBsAg，从而对所有HBV产生抵抗力，这也是目前研究的热点，其中双阳组每100个氨基酸残基突变率最高的便是“a”决定簇第一环（aa124-137），高达 5.36（χ2=23.79，P＜0.01），而对照组各区每100个氨基酸残基突变率普遍在0-2之间，但“a”决定簇第二环反而无显著区别。 因此，可能“a”决定簇第一环（aa124-137）在维持HBsAg的稳定性、空间构象及免疫原性扮演着更重要的角色。

Zhu等[11]也同样从HBsAg与HBsAb双阳性标本中也发现了大片段缺失的现象。本实验中，双阳组内发现6例Pre-S区大片段缺失。Pre-S区由于含有与免疫应答有关的T细胞、B细胞的抗原决定簇，缺失可能使宿主发生免疫逃避，且HBV包膜蛋白与病毒颗粒在肝细胞内质网滞留，形成GGH（毛玻璃样肝细胞）[12]，引起内质网发生应激反应，产生大量的活性氧自由基，造成DNA损伤，导致基因组不稳定，最终发生肝细胞癌变，因此，Pre-S区发生大片段缺失可能是原发性肝细胞癌发生的独立危险因素[13]。且双阳组内发现7例S区发生无义突变，在国内鲜有报道。无义突变导致蛋白翻译提前终止，且由于S区参与构成主蛋白（HBsAg）、表面抗原中蛋白、表面抗原大蛋白，这将导致构成HBV外膜的免疫原性与空间构象等产生较大改变，造成HBsAb无法完全中和HBsAg而产生双阳性现象。

双阳组的Pre-S/S区杂合突变率54.4%（35/64）显著高于对照组27.8%（20/72），测序中检测到杂合突变峰可能是由于体内存在不同的病毒优势株导致，人群中的HBV感染大多无法根治，少量变异株经过长年累月的复制，成为感染的优势株。虽然测序方法对于突变株的检出相对不敏感，只能检出含量达10%的突变株，但实验所得的数据差异仍有统计学意义（χ2=5.104，P＜0.05），说明 HBsAg 和HBsAb双阳性的出现可能与体内存在丰富的病毒准种构成有关。

综上所述，乙肝病毒Pre-S区的“a”决定簇第一环、C端、N端发生氨基酸突变可能与HBsAg和HBsAb双阳性发生有关，且C基因型的突变率较B基因型高，可能与C基因型患者更易发生终末期肝病有关。同时，本文双阳组内发现有S区无义突变、Pre-S区大片段碱基缺失、病毒准种构成丰富的现象，符合当代学者对于产生HBsAg和HBsAb双阳性机制的猜想，但目前缺乏数据证实，因此，HBsAg和HBsAb双阳性现象更可能由多种原因共同驱动所致。