高危型HPV感染共刺激分子B7-H1的表达及其与宫颈上皮内瘤变的相关性

王珍，应慧群，舒媚

（永康市中医院，浙江 永康 321300）

目前已知的人乳头状病毒（Human papillary virus，HPV）有200多种，其中40多种与生殖道感染相关[1]。高危型HPV16是常见感染的高危型人乳头状病毒，且在多数宫颈上皮瘤变和宫颈癌患者中均可检测到[2]，故高危型HPV16宫颈上皮瘤变可能有关。B7免疫球蛋白超家族成员-1（Member of B7 immunoglobulin superfamily-1，B7-H1）等共刺激分子是T细胞或B细胞完全活化后提供共刺激信号的细胞表面物质，又称“程序性死亡配体-1”，与上皮细胞异常表达的免疫调节有关，与受体结合可促使T淋病细胞凋亡导致肿瘤细胞逃避细胞毒性T淋巴细胞的攻击，与宫颈癌密切相关[3-4]。因此，高危型HPV16感染共刺激分子B7-H1的表达情况也可能与宫颈上皮内瘤变相关，但目前缺乏相关研究。本文探讨高危型HPV16感染共刺激分子B7-H1的表达情况，并分析高危型HPV16感染、B7-H1表达情况与宫颈上皮内瘤变级别的相关性，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 前瞻性选择2018年1月-2020年6月本院高危型HPV阳性患者160例。纳入标准：经宫颈表面、阴道穹隆分泌物PCR核酸检测确定为高危型HPV阳性的非妊娠女性，年龄15-65岁，既往宫颈筛查结果正常。排除标准：混合感染、既往有宫颈手术史、有脾切除或淋巴切除等可能损害机体免疫功能的手术史、有恶性肿瘤史、合并自身免疫疾病或正在进行免疫抑制治疗者。160例中绝经112例，未绝经48例；有分娩史143例，无分娩史17 例，年龄 42-63 岁，平均（55.8±5.5）岁，其中年龄＜50岁以下36例。研究经本院伦理学委员会审批通过且患者知情同意。

1.2 方法 （1）嘱患者在检查前3天内禁性生活、阴道内用药或盆浴，行阴道镜检查，采用10mL一次性无菌注射器取5mL生理盐水，冲洗阴道后穹窿和宫颈，回吸于无菌离心管内，收集患者阴道灌洗液，在2000rpm、3cm半径、4℃中离心处理10分钟，分层后取上清液用于相关指标检测。（2）采用qRT-PCR法检测不同HPV型感染患者阴道灌洗液B7-H1 mRNA表达水平的差异，取待检测样本，常规提取总RNA，逆转录形成cDNA。进行qRTPCR扩增反应：95℃预变性1分钟、94℃变性0.5分钟、58℃退火0.5分钟，72℃延伸1分钟，共35个循环后，72℃延伸10分钟，PCR产物常规进行琼脂凝胶电泳，采用 2-△△Ct法进行 B7-H1 的定量分析。（3）采用Western blot法检测不同HPV型别感染者阴道灌洗液B7-H1蛋白表达水平。取待检测样本行冰上裂解、蛋白质定量分析，分装并添加缓冲液，在热处理使蛋白变性、电泳后行PVDF膜转膜，行1小时的封闭处理后加入B7-H1稀释抗体孵育过夜，添加稀释二抗，以β-actin为内参，扫描灰度值，并计算B7-H1蛋白相对含量。（4）常规行阴道镜病理检查分析HPV16感染宫颈病变程度[5]，检查结果分为无病变、低级别鳞状上皮内病变（LSIL，轻度不典型增生）、高级别鳞状上皮内病变（HSIL，中重度不典型增生）、宫颈癌。

1.3 统计学处理 采用SPSS21.0软件进行数据处理。计量资料均符合正态分布，以（±s）表示，多组之间采用方差分析，并通过SNK-q检验进一步两两比较；计数资料用百分率表示，采用χ2检验；采用Spearman相关法分析B7-H1 mRNA相对表达量、蛋白表达水平与宫颈上皮内瘤变级别的关系。

2 结果

2.1 高危型HPV感染情况 160例共检出HPV16感染 65例（40.63%）、HPV18感染（21.88%）、HPV52感染（15.00%）、HPV56感染（12.50%）、HPV58感染（10.00%）。

2.2 HPV16感染的宫颈上皮内瘤变级别 HPV16感染的 65例中无病变者 20例（30.77%）、LSIL22例（33.85%）、HSIL15 例（23.08%）、宫颈癌 8 例（12.31%）。

2.3 不同高危型HPV的B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平 高危型HPV16感染者阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平均高于其他高危型HPV感染者（P＜0.05）；高危型HPV18、HPV52、HPV56、HPV58 感染者阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。 详见图 1、表 1。

表1 不同高危型HPV感染者的B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平比较（±s）

表1 不同高危型HPV感染者的B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平比较（±s）

*注：B7-H1蛋白表达=B7-H1灰度值/β-actin灰度值与 HPV16 比较△P＜0.05

高危型 HPV n B7-H1 mRNA（2-△△Ct） B7-H1 蛋白表达 *HPV16 65 0.98±0.18 0.95±0.15 HPV18 35 0.24±0.12* 0.21±0.12△HPV52 24 0.22±0.14* 0.18±0.08△HPV56 20 0.29±0.11* 0.25±0.16△HPV58 16 0.31±0.17* 0.27±0.14△F值 — 213.582 279.559 P—＜0.01 ＜0.01

图1 不同高危型HPV感染者B7-H1蛋白表达水平的Western blot检测结果

2.4 高危型HPV16不同宫颈上皮内瘤变级别的阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平比较 随着高危型HPV16感染患者宫颈上皮内瘤变级别的升高，其阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平均升高（P＜0.05），详见表2。Spearman相关分析结果显示，HPV16感染者阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平与其宫颈上皮内瘤级别均呈正相关（rB7-H1mRNA相对表达量=0.878，rB7-H1mRNA蛋白表达水平=0.825，P＜0.05）。

表2 高危型HPV16不同宫颈上皮内瘤变级别的阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平比较（±s）

表2 高危型HPV16不同宫颈上皮内瘤变级别的阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平比较（±s）

注：B7-H1蛋白表达=B7-H1灰度值/β-actin灰度值与无病变比较 *P＜0.05；与 LSIL比较 #P＜0.05；与 HSIL比较△P＜0.05

宫颈上皮内瘤变级别 n B7-H1 mRNA（2-△△Ct） B7-H1蛋白无病变 20 1.06±0.24 0.99±0.21 LSIL 22 0.90±0.19* 0.88±0.12*HSIL 15 0.81±0.20*# 0.79±0.17*#宫颈癌 8 0.72±0.16*#△ 0.68±0.15*#△F值 - 6.983 8.060 P-＜0.01 ＜0.01

3 讨论

HPV为环状双链DNA病毒，核心为7800-7900个碱基通过共价键形式组成具有遗传信息的闭合环状双链DNA，可引起人体的皮肤以及黏膜的鳞状上皮增生，其中超过40种HPV与生殖道感染密切相关，根据其生物学特征以及致癌的潜在可能性，可分为高危型和低危型，其中高危型HPV的E6和E7基因编码的原癌蛋白是导致宫颈癌发生的重要因子[6-8]。因此，高危型HPV感染及其致癌机制的相关研究对于宫颈癌预防和癌前干预具有重要的指导意义。研究中多数宫颈上皮瘤变和宫颈癌患者均可见高危型HPV16、HPV18等感染[9-11]。本研究显示，高危型HPV阳性160例中HPV16感染最多见，共65例（占40.63%），临床需重视。本研究对HPV16感染者的宫颈上皮内瘤变级别进行分析，结果发现65例HPV16感染者中仅20例（30.77%）无宫颈上皮内瘤变，其余患者均存在不同程度的宫颈上皮内瘤变，提示HPV16感染可促进宫颈癌的发生发展，高危型HPV16感染的相关研究对宫颈癌的防治具有重要意义。

宫颈癌发生发展与多种机制相关，其中免疫调节发挥了重要作用[12-13]。B7-H1是与肿瘤免疫调节密切相关因子，为B7家族成员，在与受体结合之后可诱发抑制性信号，从而诱导T细胞的凋亡以及抑制T细胞的活化和增殖，从而参与肿瘤免疫调节过程[14-16]。在正常组织细胞中，B7-H1的作用为下调效应性Y细胞功能、阻止T细胞对组织细胞过度反应导致的自身免疫学疾病；而在肿瘤细胞中，B7-H1的作用为诱导肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，促进肿瘤免疫逃逸，从而促进肿瘤的发生发展和浸润转移[17-19]。因此，B7-H1亦可能参与宫颈癌的发生发展乃至转移。

李巧稚等[20]研究证实，高危型HPV16感染可促使B7-H1在子宫颈病变中表达且B7-H1的表达与宫颈病变的病情相关，B7-H1可能为高危型HPV16感染促进宫颈病变乃至癌变的重要因素，但这一关系尚不明确。本研究比较了不同高危型HPV感染者阴道灌洗液B7-H1的表达水平，结果显示，与其他高危型HPV比较，高危型HPV16者的阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平更高，证实“高危型HPV16感染促进了B7-H1表达”的结论，与李巧稚等[20]的研究结论一致。HPV16感染后HPV E6、E7可与p53、Rb协同作用导致癌症发生，在HPV16感染初期即可上调B7-H1表达而促进肿瘤细胞逃避机体免疫监视，从而促进HPV16持续感染，并为肿瘤发生发展创造条件。本研究中，高危型HPV16感染患者随着宫颈上皮内瘤变级别的升高，其阴道灌洗液B7-H1 mRNA的相对表达量和蛋白表达水平也升高，Spearman相关分析证实了HPV16感染者阴道灌洗液B7-H1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平与其宫颈病变程度均呈正相关。

综上所述，B7-H1与高危型HPV16感染及宫颈病变均密切相关，可能成为高危型HPV16感染宫颈癌前病变预防性干预的靶点。