PKCα对脂多糖诱导的C57BL/6J小鼠急性肺损伤中细胞自噬及焦亡的调节作用*

陈 杨， 林鹏程， 苏珊珊， 周腾飞， 施强强， 董 年， 董 莉， 李玉苹

（温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，浙江温州325000）

急性肺损伤是临床上常见的危及生命的呼吸系统疾病，发病率和死亡率均很高，其特点表现为顽固性低氧、气体交换受损、过度炎症反应和急性呼吸衰竭［1］。虽然现代医学技术、新型抗菌药物和器官功能支持技术等被广泛应用，但因其发病机制复杂，治疗效果尚不理想。蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PKCα）是蛋白激酶家族中的经典成员，其激活将触发下游不同信号级联反应，调节各种细胞功能，如增殖、分化、凋亡和转化等，在肺内炎症和肺部肿瘤等疾病中发挥关键作用［2-3］。近年来，研究显示PKCα参与急性肺损伤的发生发展，例如，短暂性脑缺血/再灌注诱导的大鼠急性肺损伤的发病与肺组织中PKCα mRNA 和蛋白表达显著增加相关［4］。我们在前期预实验中也观察到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导急性肺损伤小鼠和RAW264.7 细胞中PKCα的磷酸化水平均显著上调。基于此，我们猜测PKCα 是急性肺损伤潜在的治疗靶点。此外，PKCα参与调节细胞自噬及细胞焦亡过程，例如，在人胚胎肾细胞相关研究中，葡萄糖剥夺可诱导自噬水平上调，但抑制PKCα 表达后，葡萄糖剥夺未能诱导自噬水平上调［5］。空气中悬浮颗粒物通过激活PKCα 促进口腔胶质细胞核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体形成、活化，从而促进炎症反应发生［6］。但 PKCα 对 LPS 触发的急性肺损伤中细胞自噬及焦亡的调节作用尚未可知。因此，本实验以LPS 构建急性肺损伤体内外模型，通过PKCα 特异性抑制剂 calphostin C 抑制 PKCα 后检测细胞自噬及焦亡水平，探讨PKCα在急性肺损伤中的调节机制。

材料和方法

1 材料

SPF 级雄性 C57BL/6J 小鼠（6～8 周龄，20～25 g）购自北京维通利华实验动物技术公司，许可证号为SXCK（京）2016-0011，饲养于温州医科大学动物实验中心SPF 级实验动物房。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 购自上海中科院细胞库。LPS（O55：B5；L2880）和 calphostin C（C6303）购自 Sigma；PKCα（phospho S657）抗体［EPR1901（2）］（ab180848）购自Abcam；NLRP3 抗 体（D4D8T）、cleaved caspase-1（Asp296）抗体（E2G2I）、caspase-1 抗体（E2Z1C）、含caspase 募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domian，ASC）/TMS1抗体（D2W8U）、微管相关蛋白1 轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）抗体、SQSTM1/p62 抗体、β-actin 抗体（13E5）和 GAPDH 抗体（D16H11）XP®购自CST；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo；ELISA试剂盒及RT-qPCR引物购自上海博蕴生物科技有限公司。

2 方法

2.1 小鼠模型 将45 只C57BL/6J 小鼠随机分为空白（control）组、DMSO 组、DMSO+calphostin C 组、LPS组和LPS+DMSO+calphostin C 组，每组9 只。将calphostin C 溶于DMSO（1 g/L），用PBS 稀释至0.015 g/L，按0.15 mg/kg 的剂量腹腔注射预处理4 h。4%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉后以静脉留置针经口气管插管，接1 mL 针筒后以水柱随呼吸上下浮动作为插管成功标志。将LPS 以10 mg/kg 的剂量经气道滴入（将LPS 溶解于PBS 中，浓度10 g/L，其余组予等体积的PBS 气道滴入）刺激24 h 后，安乐死小鼠，获取支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）及肺组织标本。

2.2 细胞模型 将RAW264.7 细胞分组如下：control 组、DMSO 组、DMSO+calphostin C 组、LPS 组和LPS+DMSO+calphostin C 组。取生长状态良好的对数生长期细胞，经细胞计数器计数，6 孔板按照每孔8×105密度铺板，12 孔板按每孔4×105密度铺板，使用含10%胎牛血清的DMEM 培养液，置于培养箱中培养12 h。次日倒置显微镜下观察细胞状态，长至80%～90%左右时，用calphostin C（100 nmol/L）预处理细胞2 h后予LPS（1 mg/L）刺激6 h及24 h，6 h后提取蛋白及RNA 检测细胞焦亡水平，24 h 后提取蛋白检测细胞自噬水平。

2.3 BALF 蛋白浓度及炎症因子测定 BALF 样本经4 ℃、111.8×g离心后获取上清液。采用BCA 法测定蛋白浓度。采用鼠相应ELISA 试剂盒测定炎症细胞因子白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）浓度。

2.4 HE染色 经留置针向全肺注入0.4 mL多聚甲醛，用细线结扎后将完整肺组织浸泡于多聚甲醛中固定，随后石蜡包埋切片，脱蜡、水化处理，再经苏木素及伊红染液染色后脱水封片，在显微镜下观察并进行肺损伤病理分级评分（0～4 分制）：无损伤=0；损伤25%=1；损伤50%=2；损伤75%=3；弥漫性损伤=4。

2.5 免疫组化染色 取小鼠石蜡切片，脱蜡、水化、阻断、抗原修复、封闭，5% BSA 室温放置30 min，滴加适量LC3B、p62 和NLRP3 抗体（1∶100）4 ℃孵育过夜。PBS 清洗3 次后，Ⅱ抗37℃孵育60 min。PBS 清洗后，滴加适量DAB 显色液5～10 min，自来水冲洗5 min。中性树脂封片后显微镜下观察肺组织中相应蛋白的表达。

2.6 Western blot 取上述不同实验干预后的小鼠肺组织及RAW264.7细胞，用细胞裂解液裂解，4 ℃、20 913×g离心 10 min 提取上清液，使用 BCA 测定蛋白浓度。各组分别取30 μg 蛋白进行SDS-PAGE，湿转至PVDF 膜，快速封闭液室温下封闭10 min，相应Ⅰ抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜 10 min×3 次，Ⅱ抗（1∶5 000）室温孵育1 h，再用TBST 缓冲液洗膜10 min×3次，化学发光法显影条带。

2.7 RT-qPCR 按照Trizol 说明书提取上述不同实验干预后的RAW264.7 细胞总RNA，分光光度法测定RNA 质量和浓度。取总RNA 2 μg 反转录为cDNA，再以适量cDNA 为模板进行real-time PCR。反应条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参照，数据以 2-ΔΔCt计算。引物（鼠源）序列如下：GAPDH 的上游引物序列为5′-CACGGCAAATTCAACGGCACAG-3′，下游引物序列为 5′-AGACACCAGTAGACTCCACGACATAC-3′；IL-1β的上游引物序列为5′-CACTACAGGCTCCGAGATGAACAAC-3′，下游引物序列为5′-TGTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTAC-3′；IL-18 的上游引物序列为 5′-AAGAAAGCCGCCTCAAACCTTCC-3′，下游引物序列为 5′-TTGACGCAAGAGTCTTCTGACATGG-3′；NLRP3的上游引物序列为5′-GGAGGAAGAAGAAGAGAGGAGAGGAG-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CTTGAGAAGAGACCACGGCAGAAG-3′；ASC 的上游引物序列为 5′-GGACGGAGTGCTGGATGCTTTG-3′，下游引物序列为 5′-CATCTTGTCTTGGCTGGTGGTCTC-3′；caspase-1 的上游引物序列为 5′-TGAATACAACCACTCGTACACGTCTTG-3′，下 游 引 物 序 列 为 5′-CCAGATCCTCCAGCAGCAACTTC-3′。

3 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。数据采用均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 抑制PKCα可减轻LPS诱导的C57BL/6J小鼠急性肺损伤，减少BALF中炎症因子分泌

肺组织HE 染色及病理分级评分显示，LPS 组可见显著的肺泡及间质水肿、肺泡塌陷、炎症细胞浸润等（P＜0.01），而抑制PKCα 后肺组织病理学改变明显好转，肺损伤评分显著降低（P＜0.01），见图1A、B。此外，抑制PKCα可显著降低BALF中蛋白浓度及IL-1β和TNF-α的分泌（P＜0.01），见图1C～E。

2 抑制PKCα可逆转LPS诱导的C57BL/6J小鼠肺组织自噬水平

Western blot 及免疫组化结果显示，LPS 能显著诱导小鼠肺损伤中自噬相关蛋白LC3B 及p62 表达水平上调（P＜0.01），而 calphostin C 预处理抑制PKCα 后能部分逆转上升的 LC3B 及 p62 水平（P＜0.01），见图2。

3 抑制PKCα可逆转LPS诱导的C57BL/6J小鼠肺组织焦亡水平

肺组织免疫组化结果显示，与control 组相比，NLRP3 阳性染色程度在LPS 组更显著（P＜0.01），而LPS+DMSO+calphostin C 组较 LPS 组显著下降（P＜0.01），见图3。

4 抑制PKCα 可降低LPS 诱导的巨噬细胞自噬及焦亡水平

如图4A 所示，与体内Western blot 结果一致，PKCα 抑制剂能部分逆转LPS 诱导的巨噬细胞自噬水平相关蛋白LC3B 及p62 的上调（P＜0.05）。如图4B 所示，LPS 组 NLRP3、C-caspase-1 和 ASC 蛋白水平较空白组显著上调，而calphostin C 能抑制LPS 触发的细胞焦亡（P＜0.01）。同样，RT-qPCR 结果也显示抑制PKCα 能降低LPS 诱导的巨噬细胞NLRP3 炎症小体相关mRNA水平（P＜0.05），见图4C。

讨 论

Figure 1. Inhibition of PKCα attenuated LPS-triggered acute lung injury and secretion of inflammatory mediators in the BALF from C57BL/6J mice. A：histopathological analysis of lung tissues by HE staining（scale bar=100 μm）；B：severity of lung injury evaluated by semi-quantitative histological scoring；C：BALF protein levels evaluated by BCA method；D：the level of IL-1β in BALF examined by ELISA；E：the level of TNF-α in BALF examined by ELISA. Mean±SD. n=3；#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.图1 抑制PKCα可减轻LPS诱导的C57BL/6J小鼠急性肺损伤并减少BALF中炎症因子分泌

急性肺损伤的主要病理生理机制为过度炎症反应导致的气血屏障功能破坏，继而引发肺水肿及气体交换障碍，其致病因素包括严重感染、创伤、中毒和休克等。LPS是革兰阴性细菌细胞壁主要成分，可激活机体固有免疫系统，引起炎症瀑布效应，导致全身炎症反应失控，是急性肺损伤常见诱发因素之一。由于LPS 攻击模型方法简单，且与临床发病过程类似，故LPS 常用于构建急性肺损伤动物或细胞模型［7］。已知PKCα 是经典型激酶成员之一，可被炎症因子、激素及神经递质等激活，在肺损伤过程中细胞增殖、分化和凋亡等多种病理生理过程中发挥重要调节作用。结合目前文献报道细胞自噬及焦亡也参与急性肺损伤中的病理生理过程，本文拟深入研究PKCα 能否调节LPS 触发的小鼠急性肺损伤中细胞自噬及焦亡过程。本实验以10 mg/kg 的LPS 气管内滴注刺激C57BL/6J小鼠24 h成功构建急性肺损伤模型，并以PKCα 特异性抑制剂calphostin C 在体内外抑制PKCα 活化后检测细胞自噬及焦亡水平。为评估肺屏障功能及肺内炎症，实验检测了BALF中蛋白浓度及炎症介质IL-1β和TNFα水平。与空白对照组相比，LPS气管内滴入可明显破坏小鼠肺内皮屏障功能造成肺泡内蛋白质渗漏，同时诱导过度炎症反应发生，而抑制PKCα 后肺损伤病理学改变显著改善，肺内炎症反应减轻。本实验证实抑制PKCα 在小鼠急性肺损伤中发挥了抗炎保护效应。

针对PKCα 对LPS 诱导的小鼠肺损伤中细胞自噬过程的调节，我们体内外实验结果显示LPS 刺激下自噬相关蛋白表达水平升高，而抑制PKCα后可逆转LPS 诱导的自噬流变化。已知自噬是细胞吞噬各种病原体以及胞内变性蛋白质、受损细胞器，经由溶酶体被降解的分解代谢过程。这个过程主要包括吞噬细胞膜诱导、吞噬泡形成、自噬体延伸及成熟、吞噬-溶酶体复合体融合、吞噬物降解［8］。自噬相关蛋白LC3B-I 向LC3B-II 的转化水平可作为判断自噬体形成的标志物，与自噬活性密切相关。p62是一种重要的自噬接头蛋白，可与LC3B-II 结合，将泛素化的蛋白聚集体或者其它细胞组分募集到自噬小体中，然后在自噬溶酶体内一起被降解［9］。在正常生理条件下，自噬发生可以维持细胞内环境稳态。在应激或损伤情况下（如营养剥夺、饥饿和创伤），自噬主要作为细胞生存的适应防御机制而存在。但某些情况下，自噬水平低下或过度或者紊乱均可引发细胞死亡和组织损伤等［10］。在本研究中，自噬水平在LPS诱导小鼠急性肺损伤中显著上调，但其作为适应性反应或是致病机制加重损伤尚未明确。因此，对LPS诱导的自噬水平进行干预，深入研究自噬稳态在急性肺损伤发生发展中的作用具有重要意义。另外，关于PKCα 信号通路调节自噬的相关报道也是相互矛盾。粉防己碱是一种新型PKCα抑制剂，通过抑制PKCα 活性诱导自噬发生［11］。而我们的研究显示LPS 诱导小鼠肺组织及RAW264.7 细胞中LC3B-II/I水平较对照组显著增加，抑制PKCα后能在体内外部分逆转这些自噬流变化，与Choi 等［5］报道的药物抑制 PKCα 以及 siRNA 转染 PKCα 可以有效地阻止葡萄糖剥夺诱导的LC3B-II 水平的增加结果相似。此外，本实验结果还显示LPS 诱导下p62 蛋白水平升高，与先前多项研究观点一致［12-13］，我们认为p62 上调可能是自噬流紊乱过程，即自噬体虽然形成，但自噬降解过程受阻导致自噬体积累。积聚的自噬体被挤出胞外引起促炎反应从而加重机体炎性损伤。我们的研究结果表明在LPS 诱导的小鼠急性肺损伤中自噬流发生紊乱，而PKCα 参与了该自噬流的调控过程。

Figure 2. Inhibition of PKCα reversed LPS-induced autophagy in lung tissue of C57BL/6J mice. A：Western blot was used to observe the protein levels of p-PKCα，LC3B and p62；B：immunohistochemical analysis of the expression of LC3B and p62（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3 to 6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.图2 抑制PKCα可逆转LPS诱导的C57BL/6J小鼠肺组织自噬水平

Figure 3. Inhibition of PKCα reversed LPS-triggered pyroptosis in lung tissue of C57BL/6J mice（immunohistochemical staining for NLRP3，scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.图3 抑制PKCα可逆转LPS诱导的C57BL/6J小鼠肺组织焦亡水平

目前多项研究提示细胞焦亡是促进急性肺损伤中过度炎症反应发生发展的重要因素之一，干预细胞焦亡可显著改善肺内过度炎症反应。鉴于细胞焦亡主要发生于巨噬细胞，而巨噬细胞在急性肺损伤发病的过度炎症反应中也发挥了重要作用，我们采用了LPS 刺激RAW264.7 巨噬细胞建立体外模型进行验证。NLRP3炎症小体是促进巨噬细胞焦亡启动的关键环节，是由 NLRP3、pro-caspase-1 和 ASC 组装成的复合体。该复合体在识别病原体相关分子或危险相关分子后激活caspase-1，从而导致细胞膜小孔形成，最终细胞肿胀破裂并释放IL-1β 和IL-18 等炎症介质参与炎症反应［14-15］。例如，在光气诱导急性肺损伤小鼠模型中NLRP3 炎症小体形成及活化，通过抑制 NLRP3 或 caspase-1 表达，下调了 IL-1β 等炎症因子释放水平，有效改善了肺损伤［16］。另外，LPS 诱导的急性肺损伤中，干扰素基因刺激蛋白活化NLRP3 炎症体而触发细胞焦亡是IL-1β 及IL-18 等炎症因子过度释放的重要病因［17］。与上述结果相似，本研究也证实在LPS 诱导的小鼠急性肺损伤中NLRP3炎症小体明显活化，细胞焦亡在急性肺损伤过度炎症反应发生发展中发挥重要诱导作用。此外，既往研究已表明PKCα 与NLRP3 炎症小体形成活化关系密切。在结核分枝杆菌感染的巨噬细胞，磷酸化的PKCα 是介导NLRP3 炎症小体形成的必要因子，抑制PKCα 表达明显抑制了NLRP3 形成及巨噬细胞相关炎症反应［18］。基于此，我们对PKCα 在LPS触发的小鼠肺损伤中细胞焦亡的调节机制做了初步探索。在体内外实验模型中，我们观察到calphostin C 抑制PKCα 表达后可显著逆转LPS 诱导的细胞焦亡水平。结合以上结果，我们率先阐明在LPS 诱导的小鼠急性肺损伤中，抑制PKCα后的抗炎保护效应与其抑制细胞焦亡过程存在密切联系。PKCα-NLRP3 炎症小体通路参与了LPS 诱导的小鼠急性肺损伤的病理生理过程。

本研究仍存在一些不足之处：首先，在体外研究中，我们只采用了单一的小鼠RAW264.7 巨噬细胞进行验证，未来我们将分离原代巨噬细胞、原代肺泡上皮及内皮细胞等，以更全面严谨的角度深入研究；其次，我们发现了PKCα 抑制分别对LPS诱导的自噬及焦亡水平所产生的影响，但尚未对自噬及焦亡靶点进行干预，对两种之间的联系，以及PKCα 在其中的调节尚未深入探索。既往文献表明自噬及焦亡之间确实存在着相关性。例如，在创伤性脑损伤中，自噬激活能下调IL13/IL-13Rα1 的表达，抑制JAK-1/STAT-1信号通路，从而抑制细胞焦亡，发挥神经保护作用［19］。在动脉粥样硬化的体外巨噬细胞模型中，电刺激激活的自噬能抑制ROS 的产生，从而减少NLRP3活化抑制细胞焦亡所介导的炎症反应［20］。因此，PKCα-自噬/焦亡轴在急性肺损伤中的潜在调节机制是一个值得探索的新方向。

Figure 4. Inhibition of PKCα reversed LPS-induced autophagy and pyroptosis in macrophages. A：the protein levels of p-PKCα，p62 and LC3B measured by Western blot；B：the protein levels of p-PKCα，NLRP3，cleaved caspase-1（C-caspase-1），caspase-1 and ASC measured by Western blot；C：the mRNA levels of IL-1β，IL-18，NLRP3，caspase-1 and ASC evaluated by RT-qPCR. Mean±SD. n=3 to 6.#P＜0.05，##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LPS group.图4 抑制PKCα可降低LPS诱导的巨噬细胞自噬及焦亡水平

综上所述，本研究在体内外证实抑制PKCα能降低LPS 触发的细胞自噬及焦亡水平，从而减轻C57BL/6J小鼠肺内过度炎症反应，对PKCα在LPS诱导小鼠急性肺损伤中的调节机制做了初步探索。