NGAL用于急性肾损伤早期诊断的研究进展

黄贝贝，刘孝琴，陈丽梅，陈 红

(牡丹江医学院附属红旗医院肾内科，黑龙江 牡丹江 157011)

研究发现，急性肾损伤(Acute Kideny Injury，AKI)的发病率越来越高，由北京大学第一医院牵头的包含2223230例住院患者的研究显示，AKI的院内病死率已经达到12.4%[1]。在另一项包含3687例患者的研究中，AKI的发病率已高达54.7%，且90天死亡率随着AKI严重程度的加重而增加[2]。AKI的发生会增加慢性肾脏病、心血管疾病的发生风险，从而极大地影响了患者的临床预后及生存质量。此外，AKI还是危重症患者的严重并发症。研究发现，入住重症监护病房的患者并发AKI的概率为15%～80%，并发AKI患者全因死亡率约为非AKI患者的3倍 (27.9%，9.3%)[3]。然而，AKI早期症状不典型，且缺乏早期诊断指标，常常影响及时的诊疗。如果能够早期诊断AKI，那么无论是对于患者的临床预后还是生存质量方面都能有很大的改善。怀揣着这个目的，人们开展了一系列研究。最终，以中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin，NGAL)为代表的生物标志物进入了人们的视野。本文就NGAL的生物学作用及其与AKI的关联方面做一综述。

1 AKI

AKI过去称为急性肾衰竭(Acute Renal Failure，ARF)，是指由各种病因引起的短时间内肾功能快速减退而导致的临床综合征。常见的危险因素包括休克、败血症、肝病、凝血功能障碍、呼吸衰竭、机械通气和血管插管[4]等。根据病因发生的解剖部位，将AKI分为肾前性、肾实质性和肾后性。其中，由肾前性氮质血症或急性肾小管坏死所致的AKI约占所有AKI事件的3/4[5]。AKI患者的临床表现多样，轻重程度差别很大。肾前性AKI患者主要是血容量不足的表现(如心动过速、绝对性或体位性低血压、中心静脉压降低及黏膜干燥等)，肾性AKI患者，如药物所致AKI患者主要表现为用药数日或数周后突然起病，可出现发热、药疹、贫血、神经系统损害和肝功能损害[6]。肾后性AKI多继发于尿路梗阻，患者常出现少尿、无尿、高血压、尿毒症等[7]。AKI的诊断是依据2012年改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease：Improving Global Outcomes，KDIGO)发布的临床实践指南[8]：48 h内血肌酐(Serum Creatine，sCr)绝对值升高≥0.3 mg/ dL(26.5 μmol/L)或确认或推测7 d内sCr较基础值升高≥50%(增至1.5倍)或尿量小于0.5 mL/(kg·h)超过6 h。AKI的治疗原则是早期识别并纠正病因。越早诊断出AKI就能越早开始干预性措施或者调整治疗措施，从而减轻肾脏受损，还有助于肾功能早日恢复正常。

2 有助于早期诊断AKI的标志物

由于应用sCr和尿量的动态变化来诊断AKI有以下局限性：首先，sCr和尿量容易受到肾外因素影响，如年龄，性别，新陈代谢，蛋白摄入量，消化道出血等；其次，sCr是GFR依赖性指标，不能反映肾小管是否受损；最后，当GFR下降到1/3时sCr才明显升高，sCr的动态变化具有滞后性。此外，在肌肉含量低而肾功能受损的患者，sCr的数值也可处于正常参考范围内[9-10]。科学家们进行了大量的研究，终于发现了一些有助于早期诊断AKI的标志物。这些标志物大致分为3类：第一类为肾小球功能标志物：如反映肾小球滤过功能的低分子量蛋白质；第二类为肾小管损伤标志物：如在肾小管细胞损伤后释放到尿液中的酶；第三类为炎症介质：由肾细胞释放，或炎症细胞浸润，如NGAL、白介素-18(Interleukin 18，IL-18)等，我们可以通过这些生物标志物来确定损伤的部位和性质[11]。

3 NGAL的结构与生物学作用

NGAL最早是在1989年，Allen等人在研究基质金属蛋白酶家族(Matrix Metalloproteinases，MMPs)时被发现的[12]，它的相对分子质量为25 KD，有单体、二聚体及与基质金属蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9，MMP9)共价结合的异二聚体三种存在形式。NGAL是脂质运载蛋白家族的成员，该家族成员均拥有一个保守的三级结构“载脂蛋白折叠”，即由8个反向平行β折叠形成的桶状封闭的花萼结构，这一结构使得该家族成员能够结合疏水性的小分子物质而形成复合物，甚至可以在细胞表面结合特异性受体[13]。同时，由于NGAL的β折叠桶较脂质运载蛋白家族的其他成员更大、更开放，使配体结合腔更浅，使得NGAL可以与一些蛋白质分子(如明胶酶B或MMP9)形成分子间二硫键，以此调节这些蛋白的活性或功能[14]。目前已知的NGAL受体主要有两种，一种是megalin-cubulin受体，另一种是24p3受体。前者是NGAL非特异性的蛋白结合体，后者与NGAL特异性结合。Goetz等人研究显示，NGAL最重要的配体是铁载体(siderophores)结构。NGAL主要表达于中性粒细胞、巨噬细胞、脂肪细胞，在结肠、肾、胃、肝等组织中少量表达。NGAL的具体生理功能尚不完全清楚，研究发现，MMP9能够降解细胞外基质，调节细胞的黏附能力，还能促进细胞外基质释放血管内皮细胞生长因子，从而促进新生血管的形成。NGAL与MMP9结合形成复合物后，能够阻止MMP9降解，有助于稳定和增强MMP9的酶活性，从而起到参与机体免疫应答、脂质代谢、肾脏损伤的修复的作用[15]。2013年由Singer[13]等人的研究也证实NGAL与机体的脂质代谢、细胞分化及凋亡、炎症反应、胚胎发育、氧化应激等重要的生理活动均相关。

4 NGAL与AKI

NGAL主要由肾脏代谢，清除半衰期为10-20min。NGAL主要在远端小管和集合管产生，在正常近曲小管上皮低表达。但是，在受损的近曲小管上皮细胞，血清及尿液NGAL均高表达[16]。已有大量研究发现，当机体受到一定的炎性刺激后产生一定的应激反应或相关上皮细胞受到一定的损伤时即可诱导受损的肾小管产生大量NGAL，通过应用NGAL抗体对不同疾病(炎症、损伤等)所致AKI患者进行非还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹检测患者尿中NGAL分子形式及含量，发现AKI患者尿中NGAL单体的含量较高，表明了AKI患者的NGAL主要以单体形式被肾小管上皮细胞分泌[17]。在临床当中，AKI常见的病因主要有脓毒症、缺血再灌注损伤、药物等。那么，在不同种类型的AKI中，NGAL是否能够早期诊断AKI呢？

4.1 NGAL与脓毒症导致的AKI脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，是临床常见的危重症，常危及生命。脓毒症诱导的急性肾损伤(Sepsis-Induced Acute Kidney Injury，Sepsis-AKI)是AKI最常见的致病因素。国外一项包含1753例脓毒症患者的统计研究发现，Sepsis-AKI的发生率为47.5%，Sepsis-AKI住院病死率显著高于非脓毒症性AKI(70.2%比51.8%，P<0.001)[18]。Leelahavanichkul A等通过对鼠类模型进行相应处理，诱导其形成Sepsis-AKI后，发现无论是在盲肠结扎及穿刺术( Cecal Ligation and Puncture，CLP)组、CLP+双侧肾切除术(Bilateral Nephrectomy，BiNx)组还是CLP+双侧输尿管梗阻(Bilateral Ureter Obstruction，BUO) 组，在Sepsis-AKI早期，在sCr浓度尚未有明显变化时，血NGAL浓度就有显著升高。因而，可以认为血NGAL是早期诊断Sepsis-AKI的标志物[19]。

4.2 NGAL与缺血再灌注所导致的AKI缺血再灌注损伤是常见的导致AKI的原因之一，通常是由泌尿系手术、肾脏移植、结石梗阻解除等相关操作导致，其发生机制可能与组织缺氧、氧化应激、磷酸化作用相关，最终导致了肾小管功能受损甚至肾小管坏死[20]。Ming-Chang Hu等实施了一项研究，实验中将动物模型的双侧肾蒂夹闭(小鼠夹闭30 min，大鼠夹闭40 min)，而后将夹子移除，从而诱导动物模型产生缺血再灌注损伤性AKI。研究人员发现，在恢复再灌注5 h后，血和肾中NGAL水平开始升高[21]。因而，可以认为NGAL有助于早期诊断缺血再灌注所致的AKI。

4.3 NGAL与药物导致的AKI随着医疗水平的进步,临床用药品种在不断增多,药物所致急性肾损伤(Drug-induced Acute Kidney Injury，Drug-AKI)的发生率也呈上升趋势，约占医源性急性肾损伤的20%[22]。各种药物所致AKI的机制有所不同，但多通过以下机制：(1)直接损伤肾小管上皮细胞,造成急性肾小管坏死；(2)通过变态反应造成急性间质性肾炎；(3)通过影响肾脏血流动力学致病；(4)渗透性肾病；(5)药物原型或代谢产物造成肾内梗阻[23]。顺铂 (Cisplatin，CDDP) 是一种广泛应用的抗癌药物，但会引起全身其他正常组织的副作用，其中肾毒性最常见。在一项应用CDDP致大鼠发生Drug-AKI的动物实验中，在注射CDDP 12 h后肾脏病理已提示肾小管上皮细胞轻-中度浊肿，肾脏出现少量核固缩的情况下，实验动物血和尿NGAL浓度均升高了，而此时sCr浓度并没有明显变化。直到注射CDDP 48 h后，sCr浓度才明显升高。所以，可以认为NGAL有助于早期诊断CDDP导致的AKI[24]。

4.4 NGAL与其他原因导致的AKI尿路梗阻，无论梗阻部位是在上尿路或下尿路，常常导致肾后性AKI，而尿路结石又是最常见的导致尿路梗阻的因素。在Urbachat等人进行的对53例尿路结石导致的肾后性AKI患者和52例年龄、性别匹配的健康对照者的实验数据进行分析后，发现与健康对照组相比，肾后性AKI组患者sCr、尿和血NGAL均显著增高，而KIM-1数值并没有明显升高。可见，NGAL有助于诊断肾后性AKI[25]。江城[26]等人进行了回顾性研究，他们发现在输尿管结石导致的AKI患者中，血NGAL水平随AKI的严重程度而逐步上升，且NGAL的AUC为0.981,并且特异性强，敏感性高，因而认为NGAL在输尿管所致AKI中有较好的早期诊断价值。

5 NGAL是否能成为AKI的治疗靶点

已知，NGAL是由位于人类染色体9q34上的5869bp基因编码的小分子分泌蛋白，含有178个氨基酸，如果能够靶向敲除NGAL mRNA，阻止NGAL的合成，或许能够阻止AKI的形成[10]。由于NGAL在AKI发生过程中所起的作用及其作用机制尚不明确，因而不能贸然靶向敲除NGAL。目前已知，AKI的病理特点为肾小管上皮细胞损伤，炎症和血管功能障碍。有部分学者认为NGAL在AKI发生过程中起着保护肾脏的作用。已知有多种细胞死亡形式参与了AKI的发生，包括凋亡和调节性坏死。研究人员在研究调节性坏死时，发现一种新的调节性坏死信号通路[27]。这种新的调节性坏死信号通路是经由NGAL结合于铁偶联的铁载( Holo-NGAL)，再经由其膜受体(Megalin或24p3R)进入细胞内，使铁释放到细胞质中。最终通过调节细胞内铁水平变化，起到保护肾脏、调控细胞凋亡的作用。除此之外，24p3R还介导了远端肾单位上皮细胞铁螯合，阻止细菌从周围环境中获取铁，发挥抑菌作用[28]。在缺血再灌注导致的AKI实验中，人们发现了NGAL水平的升高会诱导肾脏保护性酶——血红素加氧酶-1上调，从而保护肾小管上皮细胞和改善受损的肾功能[20,29]。而另一些学者认为NGAL在AKI发生过程中起着诱导肾损伤形成的作用。研究发现，外科相关的炎症反应导致的肾小管上皮细胞损伤与核因子κB(Nuclear Factor Kappa-B，NF-κB)介导的细胞增殖和分化有关，多种促炎细胞因子和NF-κB可以诱导肾小管上皮细胞的NGAL mRNA上调，大量分泌NGAL。NGAL具有促炎效应，能够诱导各种促炎细胞因子的表达[30]，炎症作用又会进一步促进NGAL的表达。炎症、促炎因子与NGAL三者相互作用，形成恶性循环，最终导致肾损伤的形成。

6 展望

NGAL与KIM-1、sCr等AKI标志物相比优势明显，具有快速、灵敏、特异等生物学特点。尽管在肾损伤发生2 h就可以监测到血NGAL水平的升高，3 h后尿NGAL浓度升高，血NGAL和尿NGAL，它们的浓度数值变化均早于sCr，在肾损伤5 d后尿NGAL浓度仍处于较高水平[31-32]，但是要想将NGAL用于临床上早期诊断AKI，还需要解决下面这些问题：在不同人群、不同环境中应用NGAL早期诊断急性肾损伤的有效性，采集样本的最佳时间。此外，有研究发现，血NGAL水平可随着活化的中性粒细胞释放NGAL而升高，并增加肾小球滤过率，从而升高尿NGAL水平，此时患者可能合并急性细菌感染、败血症、糖尿病、慢性肾脏病[33]，却没有合并AKI。因此，需要更多的研究揭示肾损伤引起NGAL上调的机制。