未折叠蛋白反应在角膜营养不良中的研究进展

刘学睿，王丽媛，张毅，郑涛，赵楚楚，刘平

(哈尔滨医科大学附属第一医院眼科，哈尔滨 150001)

角膜营养不良是一类可影响角膜全层，多数类型与遗传有关的眼病，通常表现为双侧角膜进行性非炎症性改变，与全身系统性疾病无关[1]。角膜营养不良患者病变初期可无明显症状，但随着病情的进展，患者可出现视力障碍和(或)眼表刺激症状[1]。晚期角膜营养不良患者目前只能通过角膜移植提高视力。尽管部分发达国家的角膜移植手术发展较成熟，供体组织也相对充分，但全球角膜组织供体的日益短缺严重限制了其他部分地区角膜移植的治疗[2]。此外，角膜移植术后的排斥反应严重影响患者的生活质量[3]，这有助于推动替代性、无排斥治疗方案的开发。角膜营养不良的发病机制复杂，未折叠蛋白反应、自噬[4-6]、氧化应激[7]等信号通路参与其发病，其中未折叠蛋白反应发挥着关键作用。未折叠蛋白反应是一种适应性应激反应，异常折叠的蛋白质聚集于内质网腔时，未折叠蛋白反应通过减少蛋白质的合成，加强蛋白质的折叠和促进蛋白质的降解，从而维持细胞内的蛋白质稳态[8]。当未折叠蛋白反应被持续激活时，将失去其促生存作用而启动凋亡等信号通路[8]。目前的研究发现，在角膜营养不良中基因突变导致相关的蛋白质异常累积于内质网，并通过持续激活未折叠蛋白反应和随后的细胞凋亡通路参与疾病的进展[9-12]。现就未折叠蛋白反应在角膜营养不良疾病中的作用进行综述，为临床寻找角膜营养不良的非手术治疗方案提供分子基础。

1 未折叠蛋白反应的概述

内质网参与蛋白质转运，协助、监控蛋白质的修饰、折叠和组装。分泌蛋白和跨膜蛋白在核糖体上被翻译后，进入内质网腔中折叠、修饰，其中，正确折叠的蛋白质进入高尔基体，而异常折叠的蛋白质则停留在内质网腔中继续完成蛋白折叠过程，或者进入内质网相关蛋白降解途径，通过泛素-蛋白酶体系统被降解。停留在内质网腔中的异常折叠蛋白可刺激内质网从而引起内质网应激，进而激活适应性应激反应，这一过程被称为未折叠蛋白反应[13]。未折叠蛋白反应由肌醇需求酶1、双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶和活化转录因子6三种内质网跨膜蛋白启动。在正常条件下，3种跨膜蛋白通过与结合免疫球蛋白/葡萄糖调节蛋白78结合而保持非活性状态，当异常折叠的蛋白质积聚在内质网腔时，异常折叠的蛋白与结合免疫球蛋白竞争性结合，导致结合免疫球蛋白与3种跨膜蛋白结合减少，3种跨膜蛋白被激活并进一步诱导随后的未折叠蛋白反应信号通路[14]。未折叠蛋白反应通过3条通路缓解内质网应激：①激活的蛋白激酶样内质网激酶使真核起始因子2α磷酸化，从而减少蛋白质合成，减轻内质网负荷；②活化转录因子6与结合免疫球蛋白蛋白解离后转移至高尔基体，然后被位点1蛋白酶和位点2蛋白酶切割后激活，激活的活化转录因子6再进入细胞核，激活未折叠蛋白反应相关基因的表达进而恢复蛋白质折叠稳态；③肌醇需求酶1磷酸化后激活其自身RNA酶活性，具有RNA酶活性的肌醇需求酶1对X盒结合蛋白1的信使RNA进行剪接，使信使RNA成熟并编码X盒结合蛋白1，增强分子伴侣蛋白结合免疫球蛋白等的转录活性，缓解内质网应激环境对细胞的损伤。然而，持续的内质网应激会破坏内质网的稳态。当未折叠蛋白反应的缓冲能力不足以恢复内质网蛋白稳态时，CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT enhancer binding protein homologous protein,CHOP)基因转录被未折叠蛋白反应的3条通路大量激活，并参与其后凋亡通路的调节。未折叠蛋白反应还可以激活内质网膜上的胱天蛋白酶-12，进一步激活胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3，诱导细胞凋亡[15]。

2 未折叠蛋白反应与角膜营养不良

未折叠蛋白反应在许多疾病的发生发展中起关键作用，如神经退行性疾病、糖尿病、炎症等[16]。研究表明，阿尔茨海默病患者神经元细胞中β淀粉样蛋白异常积聚，可以通过未折叠蛋白反应通路导致神经元损伤和认知障碍[17]。在眼科疾病中，未折叠蛋白反应信号与糖尿病视网膜病变相关，抑制肺癌转移相关转录本1可以减弱内质网应激，从而减轻高糖诱导的人视网膜新生血管形成以及炎症的发生[18]。此外，未折叠蛋白反应还与白内障[19]、青光眼[20]等相关。近年来，关于未折叠蛋白反应与角膜营养不良的研究成果越来越多，研究重点集中于未折叠蛋白反应及随后的细胞凋亡通路与角膜营养不良的关系。

2.1未折叠蛋白反应与Fuchs角膜内皮营养不良 Fuchs角膜内皮营养不良是双侧进行性角膜内皮退行性疾病，其特征为渐进性角膜内皮细胞丢失、后弹力层增厚，滴状赘疣形成，最终导致角膜水肿和视力下降。Fuchs角膜内皮营养不良主要分为早发型和晚发型两类，早发型主要与Ⅷ型胶原α2链基因突变相关[21]，晚发型主要与溶质载体家族4成员11、脂氧化酶同源结构域1、锌指结构转录因子1等基因突变相关[22]。Fuchs角膜内皮营养不良是角膜移植最常见的原因之一[23]，多见于50岁左右女性[24]。组织学分析表明，Fuchs角膜内皮营养不良中受损角膜内皮细胞的死亡形式多为凋亡，由于角膜内皮细胞凋亡的病理生理机制尚不明确[25]，且已有研究表明未折叠蛋白反应参与细胞凋亡过程，由此推测未折叠蛋白反应在Fuchs角膜内皮营养不良的角膜内皮细胞凋亡中起重要作用。Engler等[9]在透射电镜中观察到Fuchs角膜内皮营养不良患者角膜内皮细胞的粗面内质网扩张，葡萄糖调节蛋白78、磷酸化的真核起始因子2α、CHOP、胱天蛋白酶-9表达明显升高，由此提出未折叠蛋白反应激活并导致角膜内皮细胞凋亡在Fuchs角膜内皮营养不良中可能起关键作用。

在Fuchs角膜内皮营养不良中，未折叠蛋白反应激活的机制尚不清楚，可能与基因突变相关。Jun等[26]通过敲入突变的Ⅷ型胶原α2链基因，构建Fuchs角膜内皮营养不良小鼠模型，观察发现角膜内皮细胞数量减少，内质网扩张，并检测到未折叠蛋白反应及其相关凋亡标志物表达明显上调，表明Ⅷ型胶原α2链基因突变可能激活未折叠蛋白反应及其相关凋亡。这可能是因为突变Ⅷ型胶原α2链蛋白的二级或三级结构发生改变，导致蛋白质错误折叠而积累于内质网，进一步激活未折叠蛋白反应[26]。Fuchs角膜内皮营养不良也可能与其他基因突变相关，如溶质载体家族4成员11基因突变导致其编码的跨膜蛋白不能正确定位到细胞表面，而累积于内质网[27-28]，脂氧化酶同源结构域1基因突变亦可引起所编码蛋白沉积于细胞质[29]。综上所述，基因突变可能导致其编码的蛋白质异常折叠而不能正确定位，因此异常累积于内质网，并诱导Fuchs角膜内皮营养不良的未折叠蛋白反应及随后的细胞凋亡。研究发现，转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)以及TGF-β受体在Fuchs角膜内皮营养不良的角膜内皮细胞中高表达，并诱导上皮-间充质转化相关基因锌指结构转录因子1和转录因子Snail1过表达，导致Ⅰ型胶原蛋白和纤维连接蛋白等细胞外基质蛋白过度产生[30-31]。过度合成的细胞外基质蛋白积累在内质网中并持续激活内质网应激，通过未折叠蛋白反应触发内源性凋亡通路[32]。

由于角膜内皮细胞可以通过其代谢性液泵作用使角膜基质保持相对脱水状态，维持其透明性，Fuchs角膜内皮营养不良中的角膜内皮细胞过度凋亡会损害其泵功能，导致角膜水肿以及视力下降。因此，可以通过抑制过度的角膜内皮细胞凋亡对Fuchs角膜内皮营养不良进行治疗。Okumura等[31]研究发现，加入TGF-β受体抑制剂SB431542或使用siRNA敲除TGF-β受体可以抑制TGF-β信号通路，减少未折叠蛋白的产生，从而缓解未折叠蛋白反应以及减少角膜内皮细胞凋亡。

2.2未折叠蛋白反应与颗粒状角膜营养不良Ⅱ型 颗粒状角膜营养不良Ⅱ型是一种常染色体显性遗传病，由TGF-β诱导(transforming growth factor-β-induced，TGFBI)基因中第124密码子组氨酸取代精氨酸引起[33]，是常见的TGFBI相关角膜营养不良。颗粒状角膜营养不良Ⅱ型的特点为突变的TGFBI蛋白在角膜上皮层和基质层中随年龄增长而逐渐累积，导致角膜混浊及视力下降。但是突变的TGFBI蛋白累积的具体机制尚不清楚，可能与蛋白质分泌减少或降解障碍有关。在蛋白质分泌方面，TGFBI蛋白作为一种细胞外基质蛋白，通过内质网-高尔基体依赖途径分泌。在颗粒状角膜营养不良Ⅱ型患者中，突变的TGFBI蛋白在角膜成纤维细胞中分泌延迟[34]，但具体机制尚不清楚。有研究发现，癌细胞系中核糖体蛋白S3的天冬酰胺165残基的点突变可影响其自身糖基化，从而减少其通过内质网-高尔基体依赖途径的分泌[35]。因此，颗粒状角膜营养不良Ⅱ型亦可能因为TGFBI基因突变影响蛋白质生物合成后的修饰，导致TGFBI蛋白分泌延迟。突变的TGFBI蛋白修饰改变可能成为未来的研究热点。在蛋白质降解方面，在内质网应激诱导下，TGFBI蛋白通过内质网相关蛋白降解途径降解[10]。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1和Lin-12样抑制子/增强子作为内质网相关蛋白降解途径的重要组成部分，将错误折叠的蛋白质转运至胞质中，并使蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统降解[36]。然而，颗粒状角膜营养不良Ⅱ型中的Lin-12样抑制子/增强子表达减少，内质网相关蛋白降解途径因此存在缺陷，这可能导致突变的TGFBI蛋白积累[37]。此外，颗粒状角膜营养不良Ⅱ型角膜成纤维细胞溶酶体功能异常，也可能导致突变的TGFBI蛋白因自噬-降解障碍而异常累积[38]。

在颗粒状角膜营养不良Ⅱ型中，异常累积的TGFBI蛋白可能激活未折叠蛋白反应。伴侣蛋白结合免疫球蛋白、蛋白激酶样内质网激酶和磷酸化蛋白激酶样内质网激酶、肌醇需求酶1α和磷酸化肌醇需求酶1α、剪接的X盒结合蛋白1显著上调，证实了未折叠蛋白反应的激活，CHOP表达增加提示未折叠蛋白反应进一步诱导颗粒状角膜营养不良Ⅱ型细胞凋亡[10]。体外研究发现，4-苯基丁酸可以通过激活内质网相关蛋白降解途径增加TGFBI蛋白降解[10]，褪黑素可通过促进内质网腔中蛋白质的糖基化或增加Lin-12样抑制子/增强子水平减少内质网中TGFBI蛋白的异常累积[37]，且这些药物均可减轻未折叠蛋白反应的激活。目前的研究表明，突变的TGFBI蛋白可能由于分泌减少或降解障碍，导致其在内质网腔中过度累积，持续激活未折叠蛋白反应并诱导随后的细胞凋亡通路。因此，在未来的研究中，可以将未折叠蛋白反应作为颗粒状角膜营养不良Ⅱ型的治疗靶点，通过促进突变TGFBI蛋白正确折叠或增加蛋白质降解，减少突变TGFBI蛋白在内质网腔中的异常累积，缓解内质网压力，减少颗粒状角膜营养不良Ⅱ型角膜成纤维细胞凋亡。

2.3未折叠蛋白反应与斑状角膜营养不良 斑状角膜营养不良又称为GroenouwⅡ型角膜营养不良，由Groenouw于1890年首次提出[39]。斑状角膜营养不良是以双眼角膜基质进行性混浊为特点的常染色体隐性遗传性疾病，其特征为角膜早期出现中央基质混浊，并逐渐向周边延伸，进而导致视力下降。斑状角膜营养不良发病较早，通常在10岁左右出现角膜基质改变，30岁左右视力严重下降[40]。患眼中角膜硫酸角质素的合成减少可导致斑状角膜营养不良，根据血清和角膜组织中硫酸角质素的含量不同可将斑状角膜营养不良分为3种免疫表型(Ⅰ型、ⅠA型和Ⅱ型)：斑状角膜营养不良Ⅰ型患者中，血清以及角膜的上皮层、基质层和内皮层中均无硫酸角质素；斑状角膜营养不良ⅠA型患者血清中未检测到硫酸角质素，角膜基质层对硫酸角质素抗体表现出免疫反应性；斑状角膜营养不良Ⅱ型患者中，血清和角膜基质层中均可检测到低水平的硫酸角质素，角膜上皮层与角膜内皮层只可检测到未硫酸化的角质素[40]。Akama等[41]首次发现碳水化合物磺基转移酶6基因突变可能导致斑状角膜营养不良。由于碳水化合物磺基转移酶6基因所编码的N-乙酰葡萄糖胺-6磺基转移酶参与角质素的硫酸化，角膜中突变的碳水化合物磺基转移酶6基因可能导致硫酸角质素合成异常而累积，引起角膜混浊[42]。进一步研究发现，在斑状角膜营养不良中，异常硫酸化的角质素累积在角膜细胞的粗面内质网[39]，导致粗面内质网扩张[43-44]，角膜基质细胞凋亡增加[45]，由此推测异常合成的硫酸角质素累积在内质网中，持续激活未折叠蛋白反应而诱导角膜基质细胞凋亡。研究发现，斑状角膜营养不良患者的角膜基质细胞中有大量电子致密颗粒沉积，并检测出未折叠蛋白反应标志物葡萄糖调节蛋白78、CHOP显著上调，Bcl-2表达下调，凋亡小体形成，证实了斑状角膜营养不良中异常蛋白质的累积可导致未折叠蛋白反应以及随后细胞凋亡通路的激活[11]。虽然大量研究已发现未折叠蛋白反应在斑状角膜营养不良发病机制中有重要作用，但需要更多研究来探讨此过程的具体作用机制，并进一步探索最佳治疗方法以延缓甚至阻断斑状角膜营养不良的进展。

2.4未折叠蛋白反应与Meesmann角膜营养不良 Meesmann角膜营养不良是角膜上皮一种罕见的常染色体显性遗传性疾病，其特征是角膜上皮出现小的圆形微囊，最早可在出生时发病。尽管Meesmann角膜营养不良症状一般较轻或无症状，但有些患者会出现过度流泪、异物感、畏光和视力受损等症状，常被误诊为干眼症。Meesmann角膜营养不良的发病与角蛋白3基因或角蛋白12基因杂合突变相关[46-48]。角蛋白3基因和角蛋白12基因分别编码特异性角蛋白3和角蛋白12，形成角蛋白3-角蛋白12异二聚体，此异二聚体聚合后形成细胞骨架中间丝，为角膜上皮细胞的结构提供稳定性[49-51]，角蛋白12缺陷小鼠的角膜上皮细胞脆性增加[52]。为了探讨基因突变参与Meesmann角膜营养不良的具体机制，Allen等[12]通过敲入突变的角蛋白12基因构建Meesmann角膜营养不良小鼠模型，观察到角蛋白异常累积在细胞质，并检测到CHOP和胱天蛋白酶-12明显上调。上述研究进一步发现，在携带突变角蛋白12基因的Meesmann角膜营养不良患者中，未折叠蛋白反应及凋亡同样被激活，由此提出角蛋白12基因突变可导致所编码的角蛋白12异常累积，从而诱导未折叠蛋白反应及角膜上皮细胞凋亡。其中角蛋白12基因突变导致角蛋白12异常累积的原因可能是基因突变位于功能关键的螺旋起始或螺旋终止基序，导致角蛋白12结构发生显著改变而不能正确折叠[53-54]。尽管目前许多研究证明未折叠蛋白反应参与Meesmann角膜营养不良的发病，但其相关性和具体机制有待进一步研究证明。Meesmann角膜营养不良是由于基因突变所致，从理论上分析，基因治疗Meesmann角膜营养不良是可行的，且目前已有研究证明siRNA沉默的方法可能阻断角膜上皮细胞突变角蛋白12基因的表达[55-56]，未来可进一步探讨siRNA沉默的方法是否可以阻断未折叠蛋白反应及随后的角膜上皮细胞凋亡。

3 小 结

角膜营养不良多为遗传性疾病，与基因突变相关。角膜移植术治疗角膜营养不良的研究较多，其相关机制研究相对成熟，但角膜营养不良的非手术治疗尚处于初级阶段，如细胞治疗、分子治疗等。目前，研究发现部分角膜营养不良的细胞中存在蛋白质异常累积的现象，当蛋白质过度累积时，可能激活未折叠蛋白反应及随后的凋亡等相关通路。这些角膜营养不良中未折叠蛋白反应机制的研究已取得显著进展，为明确角膜营养不良的发病机制和诊疗提供了新思路。因此，为寻找新的治疗方法，未来可以在基因水平和蛋白质水平进行研究，如减少突变蛋白的生成、增加突变蛋白的降解等。