TGF-β/Smad通路在糖尿病视网膜纤维化中的研究进展

崔歌，杨志鸿，王晓妍，章宗籍，邹英鹰

(昆明医科大学基础医学院病理学与病理生理学系，昆明 650500)

目前中国有超过1亿糖尿病患者，且以平均每天3 000人，每年120万人的速度递增[1]。随着糖尿病的发展，预计到2030年糖尿病性视网膜病的发病率在发展中国家将增加69%，在发达国家将增加20%[2]。据统计，糖尿病患者平均7～10年发展为糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)，而患糖尿病20年后几乎全部发展为DR[3]。DR若未得到及时治疗，则会发生视网膜脱落，严重者致盲，不仅降低患者生活质量，还严重影响身体健康[4-5]。DR可分为两个阶段：非增殖性DR和晚期增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，当DR发展为PDR时，视网膜表面血管生成和随后发生的纤维化通常会导致纤维血管的形成，最终形成纤维血管膜，即形成糖尿病视网膜纤维化[6]，而纤维血管膜的收缩牵拉引起的玻璃体积血及视网膜脱离是PDR导致患者视力下降甚至失明的主要原因。目前PDR的治疗方法主要为对高血压、高血糖和高血脂等危险因素的控制，以及激光光凝术和部分药物治疗，如抗血管内皮生长因子制剂、皮质类固醇等[7-11]，但均未能有效治疗糖尿病所致的视网膜纤维化，因此了解糖尿病视网膜纤维化形成机制以及选择相关治疗靶点显得尤为重要。目前，糖尿病视网膜纤维化发病机制尚不清楚。有研究证明，转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β与DR的发生、发展密切相关，TGF-β/Smad通路的激活在调节眼组织血管生成、细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成和炎症细胞因子的表达中起重要作用[12-13]。现就TGF-β/Smad通路在糖尿病视网膜纤维化中的研究进展予以综述。

1 糖尿病视网膜纤维化的形成

在几种慢性疾病中，类似于恶性肿瘤中上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程，ECM蛋白产量增加和纤维化过程，内皮表型改变，即内皮-间充质转化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)已得到证实[14-16]，这种EndMT过程在某些慢性糖尿病并发症中尤为重要。EndMT影响成纤维细胞和肌成纤维细胞的发育，与纤维化的进展和PDR的发展有关[17]；且有证据显示，EndMT形成过程与EMT的发生发展过程相似，并由Smad依赖性和非Smad依赖性信号转导通路介导，由TGF-β蛋白质超家族(包括TGF-β1和TGF-β2)调控[15-16]。高血糖诱导的ECM积累是DR的主要标志[18]，而细胞增殖、ECM伸展和新生血管形成是PDR形成的关键[19]。在视网膜纤维化的早期阶段，新血管异常增生，没有纤维化组织，进入中间阶段后，半透明的纤维化结缔组织逐渐填充血管间隙，导致在后期形成密集的白色无血管瘢痕。纤维血管增生组织从其起源向周围扩展，而无血管增生组织通常是从纤维血管增生边缘延伸的薄膜，在这一系列纤维组织形成过程中纤维化产生的牵引力导致内部神经感觉视网膜与视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)分离，从而导致视网膜脱离。而新生血管的生长伴随ECM堆积，形成延伸到玻璃体内的纤维血管膜，促进视网膜表面或玻璃体腔内纤维化组织的形成[6,20]。有研究表明，TGF-β1可使增殖的RPE失去极性，发生EMT，从而增加纤连蛋白、胶原等主要ECM蛋白以及其他大量胶原蛋白的ECM成分[21]，引起糖尿病视网膜纤维化。

2 TGF-β的分子结构

TGF具有广泛的生理和病理作用，属于具有免疫调节特性的TGF家族[22]。在哺乳动物中已经发现3种TGF-β亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，三者均由112个氨基酸组成，生物学作用相似，其编码基因分别定位于染色体19q3、1q41和14q24上[23-24]。其中，TGF-β1存在于内皮细胞、造血细胞和结缔组织细胞中，TGF-β2存在于上皮组织和神经元中，TGF-β3存在于结缔组织细胞中[25-27]。TGF-β1以生物学上无活性的形式分泌，并以分子量为290 000的复合物形式存储在ECM中，其含有C端生长因子(成熟的TGF-β同型二聚体)及其前肽[称为潜伏期相关肽(latency-associated peptide，LAP)]。LAP是一种二硫键连接的二聚体，可调节TGF-β1在整个纤维化发展过程和维持组织稳态中发挥关键作用，其与TGF-β1非共价结合为潜伏TGF-β1，阻止TGF-β与细胞表面受体结合并启动信号通路；成熟的TGF-β1同型二聚体从LAP上解离对于生长因子激活和获得生物活性是必需的，病毒性糖苷水解酶、蛋白酶和细胞黏附蛋白通过靶向LAP，诱导LAP发生大规模构象变化，释放TGF-β1。此外，潜伏性TGF-β结合蛋白对大潜在复合物(large latent complex，LLC)的有效分泌表现出重要作用，主要将分泌的TGF定位在ECM发生区域。而炎症损伤等诱导ECM的发生，并增加局部细胞外潜伏的TGF-β的储存，同时也刺激了广泛的分子信号，介导成熟的生物活性TGF-β从LLC中释放出来，当从LLC分离后，TGF-β被整合素、蛋白酶-纤溶酶、高血糖、活性氧类或极端温度、低pH值和氧化等激活，这个过程为TGF-β的活化[28-30]。

3 TGF-β的调控及Smad通路

活化的TGF-β由Ⅰ型和Ⅱ型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体组成的异构复合体传递，在人类中存在7个 Ⅰ 型受体和5个 Ⅱ 型受体，包括TGF-β Ⅱ 型受体和骨形态发生蛋白受体2以及 Ⅰ 型受体活化素受体样激酶(activin receptor-like kinase，ALK)(ALK1～7)[25]，其中ALK5也称为TGF-βⅠ型受体[25,27]，根据它们磷酸化受体的不同可分为受体调节型Smads、共同通路型Smads和抑制型Smads，其中受体调节型Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8[31-32]。Ⅰ型受体可以进一步分为两个亚群，一类是对TGF-β样蛋白反应而激活Smad2和Smad3的受体，另一类是对骨形态发生蛋白反应而激活Smad1、Smad5和Smad8的受体，激活的受体通过经典的Smad依赖性通路或非Smad依赖性通路将细胞外信号从细胞表面跨膜受体传递到细胞核，这两条通路均参与了TGF-β诱导的肌成纤维细胞的分化。可见，Smad蛋白在纤维化中起不同的作用，一些Smad发挥促纤维化作用，而其他Smad发挥抗纤维化作用[33]。

3.1经典Smad依赖性信号通路 在经典Smad依赖性信号通路中，TGF-β Ⅱ 型受体二聚体和TGF-β Ⅰ 型受体二聚体均与TGF-β配体结合形成复合物，对TGF-βⅠ型受体的GS结构域磷酸化，并磷酸化TGF-βⅠ型受体(ALK5)的丝/苏氨酸残基，进而磷酸化下游的转录因子Smad2和Smad3[34-36]。磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4形成复合体，转入细胞核内，多种非Smad共激活子(如组蛋白乙酰转移酶p300、激活蛋白-1、转录因子Sp-1和cAMP反应元件结合蛋白)和共抑制因子(如Ski原癌基因、SnoN蛋白和Smad核相互作用蛋白1)结合到含有Smad3的复合体上，从而影响不同基因的转录[25]；同时，磷酸化的Smad3激活ECM和α平滑肌肌动蛋白的转录，引起纤维化的发生。有研究显示，在动物模型中，ALK5的药理抑制作用通过ALK5-Smad3轴减弱了肝脏、肾脏、心脏、肠、脉管系统等的纤维化重构[37-41]，但有关其在糖尿病视网膜纤维化中的发病机制研究较少。此外，TGF-β配体结合ALK1和TGF-βⅡ型受体复合物，进而磷酸化激活Smad1、Smad5和Smad8的受体，激活后的Smad1、Smad5和Smad8与Smad4结合转位进入细胞核调控不同于Smad2/3/4复合物的靶基因转录[42]。但目前有关ALK1-Smad1-Smad5轴信号转导在纤维化中潜在作用的研究较少，且与糖尿病视网膜纤维化相关的研究更少。抑制型Smads主要包括Smad6、Smad7，其中Smad7是经典Smad信号通路的抑制剂，其与Samd2、Smad3竞争结合激活TGF-β Ⅰ 型受体和随后信号[43]。因此，可以在促进纤维化型Smads和抗纤维化型Smads之间取得平衡来进行抗纤维化治疗。

3.2非Smad依赖性信号通路 除经典Smad依赖性信号通路外，TGF-β还可通过非经典的信号通路(即非Smad依赖性信号通路)调控糖尿病视网膜纤维化[44]。在Smad依赖性信号通路介导的TGF-β信号机制的背景下，激活的受体也可通过促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路传递信号，包括胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基端激酶、p38 MAPK、IκB激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B，以及Rho家族鸟苷三磷酸酶，通过相关激酶激活引起非Smad依赖性信号通路作为独立通路或与Smads合作，然后整合到经典Smad依赖性信号通路上控制Smad活动，进而在多种细胞功能中发挥重要作用[45]。经典Smad依赖性信号通路和非Smad依赖性信号通路之间虽有相互作用，但在介导TGF-β所致的ECM沉积与纤维化中的相互作用尚不清楚。

4 TGF-β/Smad通路与糖尿病视网膜纤维化

TGF-β是关键的纤维化因子，与糖尿病并发症(如糖尿病肾病)有关。在胚胎发育和成人组织中，已经证明了眼中的TGF-β及其受体的表达[16]。经检测，PDR患者玻璃体液中的TGF-β2水平较无糖尿病患者高[6]，且TGF-β是EMT最有效的诱导剂[46-47]。TGF-β1经眼组织中的高糖刺激，可以异常高表达，从而传递细胞信号以发挥其生物学作用，尤其是对下游Smad3的强烈刺激作用，Smad3被激活并进一步磷酸化。磷酸化Smad3进入细胞核以传输细胞信号并使许多转录因子转录，从而进一步诱导视网膜纤维化。微RNA(microRNA，miRNA/miR)-21是一种非编码RNA，已被证实与多种疾病的发作有密切联系，能够调节多种细胞信号通路，从而对疾病的多种病理反应产生重要影响。有研究表明，DR模型大鼠视网膜组织中的miR-21表达水平明显高于正常大鼠，而TGF-β/Smad信号通路抑制剂显著减弱了miR-21在DR模型大鼠中的作用，并改善了DR模型大鼠的眼血流动力学，表明miR-21通过调节TGF-β/Smad信号通路参与糖尿病视网膜纤维化的发生[48]。有研究表明,高糖诱发糖尿病性心肌病以及EndMT，而miR-142-3p对TGF-β1具有直接调控作用，可抑制TGF-β1-Smad通路引起的EndMT，且TGF-β1是内皮细胞miR-142-3p的下游靶基因[49]，但在高糖诱发的糖尿病视网膜纤维化中miR-142-3p是否有类似作用尚不清楚。实验表明，高糖通过Smad2引起TGF-β的信使RNA上调，当使用TGF-β1抑制剂(SB431542)处理后，可防止葡萄糖诱导的ECM相关蛋白质表达水平的升高以及Smad通路的激活[50]。Smad2是miR-200b的靶标[14],高糖诱导的EndMT与miR-200b的下调以及转录共激活因子p300 的上调相关，并伴随TGF-β/Smad信号通路的激活和ECM蛋白水平的提高。Feng等[51]使用miR-200b内皮特异性过表达的转基因小鼠后进行实验，结果显示ECM相关蛋白表达水平降低。而在高糖诱导的视网膜内皮细胞EndMT的过程中，TGF-β起关键作用，且这些变化受miR-200b和转录共激活因子p300调控，从而为基于TGF-β/Smad通路诱导所致的糖尿病视网膜纤维化提供了新思路。

有文献报道，DR患者血浆心肌梗死相关转录长链非编码RNA(long non-coding RNA of myocardial infarction associated transcript，lncRNA-MIAT)表达增加，其可作为提示患者发生DR的标志物，且lncRNA-MIAT通过激活TGF-β1信号通路[52]，从而引起糖尿病视网膜纤维化，因此lncRNA-MIAT对TGF-β信号通路的调节作用可能成为治疗DR的靶点。此外，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)通过靶向包括TGF-β在内的多种信号转导通路，调节EMT在癌症转移中发挥重要作用[53]。Thomas等[44]阐述了lncRNA H19在高糖诱导的EndMT中的作用。lncRNA H19通过非Smad依赖性信号通路的MAPK-ERK1/2通路抑制高糖引起的TGF-β1介导的EndMT，而lncRNA H19是否可通过经典Smad依赖性信号通路调节糖尿病视网膜纤维化有待进一步探讨。可见，lncRNA通过经典Smad依赖性信号通路与非Smad依赖性信号通路参与高糖引起的EndMT，且lncRNA-MIAT可作为DR的潜在诊断标志物，为开发DR临床诊断方法和治疗目标提供新思路。

另有研究表明，在TGF-β诱导的人RPE系(ARPE-19)和原代人RPE中TGF-β受体2表达水平升高，且典型的间充质标志物(包括α平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白和波形蛋白)表达显著增加，实验中使用MG132(一种有效的特异性蛋白酶体抑制剂)可导致泛素化蛋白的剂量依赖性和时间依赖性累积[54]，MG132显著抑制TGF-β诱导的Smad2、ERK1/2磷酸化，其对TGF-β的信号调节，归因于TGF-β受体2表达减少，从而抑制人RPE系和原代人RPE的增殖、迁移和EndMT。该研究证明，蛋白酶体抑制剂MG132诱导的蛋白毒性应激可以抑制人RPE系(ARPE-19)和原代人RPE中的EMT过程，提示蛋白酶体抑制剂或可成为难治性视网膜纤维化疾病(如增生性玻璃体病变和PDR)的治疗方法。

以上研究表明，TGF-β是纤维化的诱导因素，是参与糖尿病视网膜纤维化过程的一种重要细胞因子，在纤维化发生发展过程参与多种通路，其中TGF-β/Smad信号转导通路已经成为治疗糖尿病视网膜纤维化的关键靶点，其相关通路的基因靶点可成为糖尿病视网膜纤维化的潜在靶点。

5 小 结

DR通常发展为慢性或不受控制的糖尿病并发症，目前通过常规眼科检查进行评估。其治疗方法主要为激光疗法，但目前可用的DR治疗策略仅适用于晚期患者，且被报道会发生严重的不良反应[55]。糖尿病视网膜纤维化的发生发展涉及多个阶段，虽然在整个疾病发展过程中TGF-β信号均参与其中，但TGF-β超家族成员在糖尿病视网膜纤维化中的作用尚不清楚，从而需要特定的糖尿病动物模型，重点关注视网膜中TGF-β信号参与的各个方面，以为寻找TGF-β/Smad信号通路上相关作用靶点和相关因子的抑制药物提供新思路。随着研究人员对相关机制研究的不断深入，今后会有更多的抗糖尿病视网膜纤维化靶点以及药物被发现，从而为治疗DR提供新思路。