Wnt/β-catenin信号通路在骨质疏松症和非骨质疏松症环境下促进成骨的研究进展

李晋蒙，王新涛

(哈尔滨医科大学附属第二医院骨科，哈尔滨 150081)

骨质疏松症可以影响骨量的形成和矿物质的产生，以及骨组织结构改变，包括宏观结构和微观结构，是一种全身性骨代谢性疾病[1]。骨质疏松症可以造成骨脆性增加，这是由于成骨细胞活性与破骨细胞活性失衡引起的一种常见骨病，常导致骨折的发生[2]。随着人口老龄化加剧，骨质疏松症患者逐渐增多，严重威胁老年人的健康。近年通过使用骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)进行的替代疗法已被认为是未来治疗骨质疏松症的重要策略[3]。BMSC是骨髓中含量最丰富的细胞，存在于体内结缔组织和器官间质[4]。BMSC还具有分化为多种干细胞的潜能，如成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等[5]。BMSC具有快速增殖、分化及取材方便等优点，被广泛用于骨组织工程的种子细胞[6]。BMSC向成骨细胞分化的过程中涉及多个复杂的信号通路，目前BMSC的成骨机制尚不明确。

Wnt信号通路在BMSC向成骨细胞分化过程中发挥重要作用，Wnt信号通路分为两类：有β联蛋白(β-catenin)参与的Wnt经典信号通路(即Wnt/β-catenin信号通路)和无β-catenin参与的非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路是近年备受关注的信号通路，也是Wnt信号通路中探索最清楚的信号通路，其对BMSC向成骨细胞分化进而促进成骨过程有重要影响。因此，Wnt/β-catenin信号通路被认为是决定间充质干细胞命运的调节因子[7]。此外，Wnt/β-catenin信号通路也是骨质疏松症治疗干预的一个有前景的靶点[8]。随着对Wnt/β-catenin信号通路研究的不断深入，发现无论是在骨质疏松症还是非骨质疏松症环境下均存在多种物质可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨，进一步证实Wnt/β-catenin信号通路在成骨过程中的重要性。现就Wnt/β-catenin信号通路在骨质疏松症和非骨质疏松症环境下促进成骨的研究进展进行综述。

1 Wnt/β-catenin信号通路概述

1984年Wnt基因被首次发现，Nusse等[9]在小鼠乳腺癌中发现Int-1基因，并且Int-1与Sharma和Chopra[10]在1976年发现的果蝇无翅基因Wingless具有较高的同源性，故将两个基因合称为Wnt基因[11]。这是人类首次提出Wnt基因。在2001年，Wnt信号通路被证实与骨量调节有关，因此Wnt信号通路受到骨科界的密切关注[12]。

在Wnt信号通路中，依据是否依赖β-catenin分为Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路。经典Wnt信号通路即Wnt/β-catenin信号通路，其转导途径是Wnt蛋白通过自分泌或旁分泌与细胞膜上受体结合形成复合物，该受体由7次跨膜的卷曲蛋白受体以及低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6共同组成，当形成复合物时，复合物活化散乱蛋白，触发细胞内的信号转导，进而抑制由糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、结肠癌抑制因子和轴蛋白等构成的蛋白降解复合物，使细胞质中的β-catenin水平增加并进入细胞核，β-catenin与核内转录因子T细胞因子/淋巴样增强因子结合，并特异性地激活下游靶基因转录；在没有Wnt蛋白作用的情况下，β-catenin蛋白在细胞质和细胞核中含量较低或缺失，这是由于β-catenin的N端被GSK-3β、轴蛋白和肠腺瘤性息肉病蛋白组成的复合物磷酸化，进而与泛素蛋白结合，将β-catenin泛素化而降解，GSK-3β可能有多种底物，但在典型的Wnt信号通路背景下，其活性受到包括肠腺瘤性息肉病蛋白和轴蛋白在内的多个蛋白形成复合物的调节[13]。Wnt/β-catenin信号通路中许多蛋白表达水平均可影响BMSC向成骨细胞分化的过程。Gong等[12]研究发现低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因突变可以影响成骨，导致骨质疏松症或骨化症，这也首次揭示了Wnt/β-catenin信号通路对骨发育起着至关重要的作用。

Wnt/β-catenin信号通路对成骨各个阶段的影响也不同。在早期阶段，β-catenin的表达可以调控BMSC分化为破骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞或软骨细胞等，同时，还对早期成骨标志物(如碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2)的表达产生影响，β-catenin在早期的活化也促进了成骨细胞的增殖；在后期，β-catenin信号下调是成骨细胞分化和骨钙素表达所必需的，因此，Wnt/β-catenin信号通路对骨骼的再生和骨骼的发育过程有重要影响[14]。除经典 Wnt信号通路外，Wnt蛋白还可以通过不同受体诱导非经典Wnt信号转导通路，这些非经典Wnt信号通路较Wnt/β-catenin信号通路更加繁杂，包括的信号通路种类众多，常见的有Wnt/Ca2+通路、Wnt/c-Jun氨基端激酶通路和Wnt/Ror2通路等[15]。

2 Wnt/β-catenin信号通路在骨质疏松症中的作用

2.1骨质疏松内环境下β-catenin的改变 骨质疏松症是一种常见的退行性疾病，主要影响高龄女性，近年的一项研究表明，50岁以上的男性中有16%患有骨质疏松症，而50岁以上的女性中有29.9%患有骨质疏松症[2]，尤其是绝经后女性，是骨质疏松症患者的高发人群。Shi等[16]分析了绝经后骨质疏松症患者的BMSC，发现转录β-catenin的CTNNB1(Catenin beta 1)基因明显低于健康对照细胞，同时，实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白质印迹(Western blot)结果显示，在BMSC成骨分化过程中CTNNB1的mRNA和蛋白表达水平升高。在骨质疏松症患者中，2型糖尿病也是导致骨质疏松症的危险因素之一。Li等[17]研究发现2型糖尿病导致的骨质疏松主要是由于骨形成受损所致而不是骨吸收增加，在2型糖尿病中骨吸收和骨形成的变化程度不同，导致骨质疏松症的发生；同时还发现在骨和干细胞等外周组织中表达的脑和肌肉芳香烃受体核转位蛋白1在2型糖尿病中表达降低，通过增加芳香烃受体核转位蛋白1的表达可抑制Wnt/β-catenin信号转导通路中GSK-3β的表达，进而显著改善BMSC驱动的骨再生；相反，增加芳香烃受体核转位蛋白1表达可抑制GSK-3β并启动Wnt/β-catenin通路，显著改善BMSC驱动的骨再生。Dong等[2]发现用于治疗2型糖尿病的安奈格列汀具有治疗骨质疏松症的潜在作用，安奈格列汀可通过Wnt/β-catenin信号通路显著增加MC3T3-E1细胞的成骨细胞分化和矿化，以及成骨关键因子重组人骨形态发生蛋白-2和Runt相关转录因子2的表达。

2.2骨质疏松内环境下体内外物质通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨 在骨质疏松的内环境下，许多体内外物质可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响成骨。Yang等[8]研究发现普遍存在于细胞外基质的纤维连接蛋白1(fibronectin 1，FN-1)可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响骨质疏松症患者的成骨，FN-1与β-catenin在体外相互作用和调节，FN-1过表达可以启动Wnt/β-catenin信号通路，进而促进成骨细胞的分化和成骨；此外，研究还发现整合素β1可与FN-1相互作用，且整合素β1对FN-1介导的Wnt/β-catenin信号通路的激活是必不可少的。Oh等[18]研究发现采用Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂Dickkopf-1(DKK-1)预处理可抑制海产品中赤贝蛋白衍生肽AWLNH和PHDL诱导的碱性磷酸酶活化和钙化，而DKK-1也可降低Wnt信号分子的mRNA表达，提示AWLNH和PHDL可以通过典型的Wnt/β-catenin信号通路促进BMSC向成骨细胞分化。Liu等[19]在去卵巢大鼠和原代成骨细胞中分别给予女贞子水提取物和含药血清，结果首次证明女贞子可以抑制去卵巢大鼠和原代成骨细胞中DKK1和骨硬化素过表达，进而诱导典型的Wnt/β-catenin信号通路来保持骨质量，表明女贞子可能为预防骨质疏松症的新来源。Chen等[1]研究发现鸢尾素在人类血液循环中的水平与骨质疏松性症有关，鸢尾素可能通过增加自噬相关蛋白12-自噬相关蛋白5-自噬相关蛋白16L复合物而上调BMSC自噬，进而提高BMSC的成骨分化能力；此外，结果还表明，在鸢尾素诱导BMSC自噬后，Wnt/β-catenin信号通路被激活，促进成骨；而BMSC自噬被抑制时则出现相反的结果。

3 Wnt/β-catenin信号通路在非骨质疏松症中的作用

3.1体内物质通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨 Wnt/β-catenin信号通路在小鼠和人的骨再生和改建过程中起重要作用。Wnt/β-catenin信号通路已成为骨代谢的重要信号通路，几乎影响骨骼生理学的各个方面。Liu等[20]实验发现，Wnt信号通路的激活可促进微循环的形成，特别是促进血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶9的表达，进而促进成年和老年雄性小鼠干骺端的骨折愈合。Liu等[21]发现分布于骨髓和血管中的感觉神经纤维分泌的神经肽Y可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化，上调和促进β-catenin的表达，此外，神经肽还可促进β-catenin向细胞核内移位，表明神经肽可能通过激活典型的Wnt/β-catenin信号通路介导BMSC向成骨细胞分化。Shi等[22]实验发现血管活性肠肽可通过激活经典Wnt信号通路促进BMSC在体外成骨和促进血管生成及分化，并通过激活经典Wnt信号转导通路刺激体内骨修复功能。Shares等[23]发现活跃的线粒体通过促进β-catenin乙酰化从而促进成骨细胞分化。

在人体中，许多基因也可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨。Lang等[24]证实miR-25基因在骨折大鼠中通过激活Wnt信号通路而过表达，进一步促进骨折愈合。Zhang等[14]实验证实miR-335-5p基因在体内和体外均能抑制Wnt/β-catenin信号通路的拮抗剂DKK-1的表达，进而促进BMSC向成骨细胞分化。Mulati等[25]发现在人类各种癌症中均有lncRNAs结直肠肿瘤差异表达基因的过表达，该基因可以在体内外促进BMSC向成骨细胞分化，并在体内调节成骨细胞的增殖。Liu等[26]发现在成骨祖细胞中高表达的G蛋白偶联受体可通过稳定β-catenin来激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进成骨分化和矿化；相反，G蛋白偶联受体基因敲除通过促进β-catenin的降解，使Wnt/β-catenin信号通路失活，从而抑制成骨分化和矿化。

Wnt/β-catenin信号通路被认为是成骨细胞分化的主要调节因子，也是脂肪细胞分化的抑制因子。Wnt/β-catenin信号通路可以通过抑制BMSC向脂肪细胞的分化而促进向成骨细胞分化。Jeong等[27]发现具有破骨细胞功能的重要调节因子跨膜蛋白64基因在小鼠体内被敲除后，可以显著增加成骨细胞的数量，减少BMSC向成脂细胞分化，还可提高胞质内β-catenin的表达水平，进而导致β-catenin向核内转移增多；相反，跨膜蛋白64过表达可抑制BMSC向成骨细胞分化进而加速向脂肪细胞的分化，并抑制β-catenin表达。Pan等[28]实验发现Yes相关蛋白具有促进成骨和抑制脂肪细胞生成的作用，并揭示了Yes相关蛋白在成人成骨和骨稳态过程中对β-catenin信号的正向调节作用。Luo等[29]发现Runt相关转录因子1通过经典Wnt信号通路促进BMSC向成骨细胞分化，并且可以抑制BMSC向脂肪细胞分化。

3.2体外物质通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨 体外物质也可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响成骨，如许多金属材料可以通过经典的Wnt信号通路促进成骨。Hung等[30]证实Mg2+通过激活经典的Wnt信号通路在骨髓腔诱导成骨效应，进而导致BMSC向成骨细胞分化。Abuna等[31]发现生长于纳米钛上的细胞可通过干扰Wnt/β-catenin信号通路中的卷曲蛋白4基因表达，进而促进成骨细胞分化。无机非金属材料硅磷酸钙(Si-CaP)具有良好的生物相容性和生物降解性，其成分与人骨中的无机成分非常接近[32]。Cameron等[33]实验发现Si-CaP可促进BMSC的附着和增殖，且与单纯羟基磷灰石相比，Si-CaP促进成骨的能力更强，Si-CaP在体外可增加骨基质的产生，在体内表现为更强的促进成骨作用。当硅浓度为0.8wt%时，Si-CaP促进成骨分化的能力最强[32]。Han等[34]实验结果表明，Si在调节BMSC增殖和Wnt/β-catenin信号通路中起重要作用。而Si-CaP是由Si取代了CaP中的一个磷离子，所以推测Si-CaP也可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进BMSC向成骨细胞分化，但还需进一步证实。

除金属材料外，许多中药物质也可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨。Sharma和Nam[35]实验证实，山柰酚可以通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化。Zhao等[36]实验证实GSK3-β的特异性抑制剂溴-靛玉红-3′-肟可以促进β-catenin进入细胞核进而在细胞核内积聚，从而激活Wnt/β-catenin信号转导通路。在中药方面也有相关报道，Zhou等[37]发现中草药物苔黑酚葡萄糖苷可以通过Wnt/β-catenin信号通路在体外促进BMSC向成骨细胞分化，还可以抑制BMSC向成脂细胞分化。Zhu等[38]实验证明梓醇可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进BMSC向成骨细胞的分化。Mo等[39]研究发现老鹳草素可以提高细胞核内β-catenin的表达水平，这是其成骨作用的重要机制。

4 结 语

骨质疏松症是全球老年人普遍存在的一种疾病，在骨质疏松症内环境下促进成骨是学者们研究的难题之一。成骨过程中涉及许多信号通路，其中Wnt/β-catenin信号通路是促进成骨过程中不可或缺的通路。在骨质疏松症环境下，可导致Wnt/β-catenin信号通路中的一些蛋白表达发生改变，进而影响成骨。在治疗方面，学者们发现无论是体内的一些基因还是体外的药物甚至一些金属离子都可以通过Wnt/β-catenin信号通路影响成骨。相信随着研究深入，Wnt/β-catenin信号通路对于骨科疾病的治疗也会起到关键作用。但是目前β-catenin与T细胞因子/淋巴样增强因子结合后作用的下游靶基因尚未研究清楚。还有研究指出Wnt/β-catenin信号过度激活可能导致BMSC衰老[40]，但最终成骨机制尚不明确。同时，Wnt/β-catenin信号通路成骨过程中涉及的蛋白众多，仍有待深入研究。