成骨细胞在不同因素影响下黏附作用的研究进展

梁文强，杨国清，张怀斌，谢犇，杨杜斌，王勇平，2

(1.兰州大学第一临床医学院，兰州 730030； 2.兰州大学第一医院骨科，兰州 730030)

骨缺损是目前骨科面临的难题之一，应用生物材料修复骨缺损是临床和组织工程研究的热点，同时生物材料需具备较强的促成骨能力。在成骨细胞与生物材料相互作用过程中，黏附是促进细胞与材料相互作用的重要起始步骤。但是成骨细胞的黏附过程涉及一系列由细胞到分子水平的复杂生理过程和物理化学变化[1]。越来越多的证据表明，成骨细胞在生物材料上的黏附是将生物物理化学信号传递给成骨细胞的关键步骤，从而启动骨整合级联反应，调节成骨细胞与生物材料之间的相互作用[2-4]。其中生物材料的表面形态、表面涂层、复合材料、孔隙结构等均可不同程度地促进成骨细胞黏附。成骨细胞黏附于生物材料的过程不仅是简单的物理过程，还涉及启动和调节细胞存活、迁移等重要过程。这些都是早期成骨细胞黏附的重要组成部分，导致成骨细胞直接附着在生物材料表面，而不需要软组织或结缔组织的干预[5]。随着研究的逐渐深入与组织工程的发展，越来越多的研究证实生物因素、等离子体以及中医药在促进成骨细胞黏附方面有一定作用。诸多因素对成骨细胞黏附产生一定的促进作用。现就成骨细胞在不同因素影响下黏附作用的研究进展进行综述。

1 生物材料表面特性对成骨细胞黏附的影响

不同的生物材料对成骨细胞的黏附具有一定影响，而且成骨细胞在生物材料上的黏附也受到生物材料的影响。生物材料的表面形态、表面电荷、孔径大小和表面生物活性等物理化学性质对成骨细胞的黏附过程有重要影响，从而影响早期成骨细胞黏附。

1.1表面形态 从微米级到纳米级的表面形态可以影响成骨细胞的黏附。骨组织表面的粗糙度约为32 nm，骨生物材料中的纳米级粗糙度也能对成骨细胞的黏附产生影响。当表面粗糙度达到纳米级后成骨细胞的黏附能力显著提升，这与纳米级的波峰使局部负电荷浓度增加进而吸附更多的纤维连接蛋白有关[6-7]。粗糙的表面增加了成骨细胞早期与材料表面的连接，更有利于细胞的黏附[8-9]。这进一步促进了细胞外基质的分泌，有利于细胞的长期黏附。但表面粗糙度>2.19 μm时，成骨细胞的黏附作用会受到一定抑制，其原因可能是过大的粗糙度导致从凸起到凹槽的距离变长，不利于成骨细胞伪足的形成[10]。Anselme等[11]研究了不同粗糙度对成骨细胞黏附的影响，发现材料表面凹槽深度加深、宽度增加可以促进细胞黏附。Eghbali等[12]使用光纤刻蚀激光装置对Ti-6Al-4V合金板材进行表面改性，并与MG-63细胞共培养后发现，当激光频率为20 kHz、刻槽距离为50 μm时，改性样品的细胞存活率较未处理样品提高了35%，当沟槽距离>50 μm时，最小激光频率(20 kHz)可减小激光脉冲的重叠，提高细胞黏附性。

上述研究表明，成骨细胞黏附可能存在最佳粗糙度。适宜的表面粗糙度可为成骨细胞提供足够的凹槽用于细胞定位和拉伸，有利于吸收更多黏附相关蛋白以促进细胞黏附。因此，可以通过物理化学的方法增加材料的表面粗糙度，达到促进成骨细胞黏附的目的。

1.2表面涂层 将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸固定在生物材料表面，可以促进成骨细胞的黏附。Verstappen等[13]将支撑脂双层膜进行精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸功能化，实现了成骨细胞前黏附和增强分化。Man等[14]制备了一种功能性Ti-6Al-4V合金，并将精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸与功能性Ti-6Al-4V合金结合，发现功能性Ti-6Al-4V合金支架更有利于成骨，这可能是由于涂层在Ti-6Al-4V合金上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽提高了成骨细胞的黏附性。通过精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽在Ti-6Al-4V合金表面共价交联形成功能性Ti-6Al-4V合金，可以增强成骨细胞的黏附和铺展，进而促进碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原基因的表达。李莺等[15]在纯钛表面制备TiO2纳米管涂层后，与Ⅰ型胶原结合发现，成骨细胞伸展完全，细胞骨架结构明显，黏附斑蛋白表达增加，促进了成骨细胞在该材料表面的黏附，表明纯钛表面TiO2纳米管结合Ⅰ型胶原可有效促进骨细胞黏附，进而促进骨整合。俞斌等[16]通过实验发现，Fe3O4多巴胺涂层修饰的聚对苯二甲酸乙二醇酯人工韧带材料可以明显增加成骨细胞的黏附。Haag等[17]将牛血清白蛋白溶解到不同浓度的CaCl2溶液中制备成表面涂层，将涂层复合到聚苯乙烯中，研究其对MC3T3-E1细胞的影响，结果发现，钙修饰的牛血清白蛋白可改善MC3T3-E1成骨样细胞的整体黏附，但过高浓度的钙会诱导细胞死亡。Xu等[18]为了提高钛的抗污性和生物活性，采用两性离子聚2-(甲基丙烯酰氧基)乙基胆碱磷酸酯[zwitter ionic poly 2-(methacryloyloxy)ethyl choline phosphate，PMCP]通过表面引发原子转移自由基聚合对钛表面进行改性，实验发现，Ti-PMCP表面具有两性离子防污性能，降低了血清白蛋白和纤维蛋白原的吸附性，Ti-PMCP参与钛表面PMCP和细胞膜上磷酸胆碱的相互作用。因此，Ti-PMCP表面可促进MC3T3-E1细胞与骨髓间充质细胞的黏附和增殖。

材料表面增加涂层是促进成骨细胞黏附的一种较为常用的方法，性状优良的表面涂层不仅可以增强成骨细胞在材料表面的黏附，还能促进成骨细胞的增殖。不同的表面涂层可使不同的黏附相关蛋白表达增加，激活信号通路，但这一过程中涉及的分子机制研究较少。

1.3复合材料 利用各种材料的不同特点制作的复合材料能够实现优势互补，使材料具有更好的细胞黏附性、细胞增殖以及生物相容性。Zhang等[19]制备了一种多孔聚醚酰亚胺支架，该支架的相对细胞黏附能力和细胞形态均优于聚醚酰亚胺和Ti-6Al-4V。Szewczyk等[20]开发了聚偏二氟乙烯薄膜，以获得表面仿生细胞外基质，在成骨细胞黏附和增殖的细胞培养研究中发现表面粗糙的薄膜能明显提高成骨细胞的黏附力[18]。Ghezzi等[21]提出了3-巯丙基三甲氧基硅烷对碳化硅纳米颗粒的功能化处理，功能化纳米线的黏附性优于裸露纳米颗粒，细胞骨架显示蛋白分布更均匀，同时基因表达分析显示，碱性磷酸酶和Ⅰ型胶原的表达水平较高。廖健等[22]将大鼠成骨细胞接种于煅烧骨/壳聚糖复合材料上，培养3 d后成骨细胞紧密黏附于煅烧骨与壳聚糖质量比为1/2、1/1、2/1的复合材料表面，伸展完全，胞体丰满并伸出伪足嵌入材料内部；培养7 d后细胞铺满材料表面，其中煅烧骨/壳聚糖质量比为2/1的复合材料表面的细胞最密集，表明煅烧骨/壳聚糖复合材料可增加成骨细胞的黏附与增殖。壳聚糖与成骨细胞具有良好的生物相容性，能够促进成骨细胞的黏附，脱细胞骨基质也有良好的生物相容性且能起到骨传导与诱导的作用，因此联合碱性成纤维细胞生长因子制备成复合支架：碱性成纤维细胞生长因子/脱细胞骨基质/壳聚糖支架，复合支架有利于成骨细胞的黏附，可促进成骨细胞的移植与成骨基因的表达[23]。研究发现，将人成骨样SAOS-2细胞接种于糖交联胶原-羟基磷灰石颗粒支架材料表面，人成骨样SAOS-2细胞能够伸展伪足迁移入支架材料内部黏附生长[24]。有文献报道，在富含SiO2的生物玻璃材料中加入MgO可以产生良好的化学环境，诱导吸附在表面的蛋白质构象发生变化，促进参与细胞黏附蛋白的表达，对细胞的黏附行为产生积极影响[25]。Liu等[26]以聚乳酸-羟基乙酸共聚物为载体，制备了成骨诱导剂缓释系统，并将其包覆在钛表面，与成骨细胞共培养后发现，PLGA+成骨诱导剂组的成骨细胞呈典型的纺锤形，数量较多，提示PLGA+成骨诱导剂可促进成骨细胞的黏附和增殖。

复合材料的优点在于能将不同材料的优良性状相结合，由于不同材料的理化性质存在差异，复合材料的制备过程较为复杂，但优良的复合材料可促进成骨细胞的黏附和增殖。

1.4孔隙结构 研究发现多孔钽有利于成骨细胞在其表面及孔隙内黏附，整合素β1及纤维粘连蛋白在成骨初期钽-骨界面表达增高，可能对早期成骨起促进作用，而在骨成熟期则表达降低，有利于成骨细胞黏附及改建[27]。Wang等[28]通过实验发现随着材料表面孔径的增大，F-肌动蛋白和碱性磷酸酶显著增加，成骨相关基因骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、Runt相关转录因子2重组蛋白和碱性磷酸酶显著上调，表明类松质多孔结构可以有效降低金属材料的弹性模量，从而避免应力集中，促进成骨细胞的黏附和增殖。O′Brien等[29]研究生产了一系列具有不同孔径和细胞附着比表面积的支架，细胞附着与支架比表面积之间存在线性关系，表明在所研究的孔径范围内(95.9～150.5 μm)，MC3T3-E1细胞的短期活性取决于可结合的比表面积。孔隙的直径对成骨细胞的黏附过程有一定影响，材料的直径对于成骨细胞黏附同样具有一定促进作用，徐玲和于卫强[30]研究了不同的TiO2纳米管对成骨细胞黏附的影响，实验结果显示，与直径为80 μm的纳米管相比，直径为30 μm的纳米管成骨细胞能更好地黏附在50 μm的纳米管上，说明成骨细胞的黏附受纳米管直径的影响。材料表面搭载一定的药物涂层对成骨细胞的黏附同样具有影响。

随着人们对成骨细胞黏附认识的深入，成骨细胞黏附不再局限于细胞在生物材料表面的物理黏附，而是一个复杂的生理过程。成骨细胞黏附除了能将成骨细胞物理附着在生物材料表面外，还能激活信号通路，控制细胞的存活、增殖、迁移和分化等一系列重要的活动。成骨细胞黏附的调控不应仅局限于物理黏附，也应关注其涉及的信号通路，将生物材料表面产生的生物物理化学信号传递到细胞内，激活下游信号通路，调节早期骨整合。研究不同生物材料的表面性质对黏附相关蛋白的影响具有重要意义，但对于材料激活的黏附相关信号通路与早期骨整合之间的关系仍不明确，忽视黏附在介导下游信号通路中的重要作用可能会导致早期骨整合的失败。未来应关注生物材料的物理附着和介导的信号通路，以促进早期骨整合。

2 生物因素对成骨细胞黏附的影响

在生物材料表面改性的研究中生物因子被广泛用于支架表面改性，其原因是生物因素本身具有促进成骨细胞黏附的作用。李娜和章非敏[31]分别在多巴胺改性、多巴胺复合Ⅰ型胶原改性的玻片和空白玻片上培养MC3T3-E1细胞，实验结果表明相对于空白玻片组，MC3T3-E1 细胞在多巴胺以及多巴胺复合Ⅰ型胶原组中铺展、黏附形态更好，表明多巴胺及多巴胺复合Ⅰ型胶原可促进成骨细胞的黏附作用。宋婷婷[32]实验发现，成骨细胞特异性识别多肽能促进成骨细胞的黏附与迁移。有研究指出，重组人甲状旁腺激素对成骨细胞的黏附具有促进作用[33]。

3 等离子体对成骨细胞黏附的影响

等离子体是一种通过电离产生的离子化气体状物质，分为热等离子体和低温等离子体两大类，通常用于材料表面改性和组织再生领域。Gonzalez-Blanco等[34]在钛片上添加硅涂层并进行酸化处理后，用氩等离子体处理材料，与人成骨MG-63细胞共培养后发现，与未经氩等离子体处理的钛片相比，经氩等离子体处理的钛片上培养的细胞黏附和增殖水平更高、线粒体损伤更小、平均细胞面积更大。有实验发现，无机牛骨通过氩气+5%氧气产生的低温氩氧等离子体进行表面活化细胞铺展较为充分，细胞表现出较好的黏附性[35]。Ghezzi等[36]设计了碳化硅和核壳碳化硅/二氧化硅纳米颗粒并研究其对小鼠成骨MC3T3-E1细胞的影响，经过氢等离子体处理后，碳化硅纳米颗粒的亲水性增加，碳化硅纳米颗粒表面润湿性的改善使接种后24 h的细胞黏附性更好，细胞呈扁平状和星状，亲水性的增强可能导致蛋白质吸附的增加。等离子体通过改变材料表面的不同性状增加了细胞黏附的能力。

4 中药对成骨细胞黏附的影响

近年基于中医药的研究不断深入，中药材对于成骨细胞的生物学行为具有一定影响。林煜等[37]研究了健骨颗粒含药血清对成骨细胞黏附的影响，结果发现随着含药血清干预时间的延长，成骨细胞表达及分泌的纤维粘连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白、黏着斑激酶信使RNA及蛋白水平逐渐升高，提示健骨颗粒能促进成骨细胞的黏附，原因在于其激活了介导成骨细胞黏附的黏着斑激酶转导通路各相关因子，使成骨细胞进入“分泌增加→黏附增加→功能增强、分裂增殖→分泌增加”的良性循环，对成骨细胞的成骨效应起正性调节作用。有研究表明，淫羊藿苷去蛋白无机牛骨复合材料表面能使成骨细胞黏附增多、分布更加均匀[38]。宋立成等[39]分析淫羊藿苷对高重力加载后细胞黏附和细胞骨架的影响发现，一定条件下的重力和淫羊藿苷干预均可促进成骨细胞黏附。

5 小 结

近年有关成骨细胞黏附的研究较多，许多研究结果显示成骨细胞的黏附是一个复杂的过程，生物材料的各种性质、生物因素、等离子体和中医药均会对其产生一定影响。良好的骨生物材料应具备良好的生物相容性、细胞附着性、细胞增殖性等。材料的表面特性如表面形态、表面涂层、孔径的大小以及复合材料均可能对成骨细胞的黏附产生一定影响。但成骨细胞在生物材料上黏附过程的调节和所涉及的信号通路可能更为复杂。促进成骨细胞在骨生物材料上的黏附还需要更多的体外与体内实验研究。随着对促进成骨细胞黏附的进一步研究，可以为临床实践中骨缺损患者的治疗提供理论与实践依据。