链霉菌DDE转座酶基因的克隆及生物信息学分析

苏爱珍，薛永常

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034）

链霉菌（Streptomyces）属于革兰氏阳性菌，是自然界中数量最多、最普遍的放线菌之一[1]，具有复杂的生活周期和次生代谢途径，产生大量具有重要价值 的天然代谢物，是研究微生物形态分化和化学多样性的良好研究材料[2,3]。链霉菌代谢产物独特的化学支架和巨大的代谢潜力使其成为生物勘探研究中最有前途的候选材料[4]。而插入序列是细菌中一种普遍存在的转座元件，结构非常简单，两侧有两个反向重复序列，发生转座需转座酶基因编码的转座酶参与[5,6]。它是细菌和古细菌中发现的可自我移动的DNA，形式简单，仅包含其自身转座所需的基因[7-9]。在细菌中，插入序列可根据其催化区域的折叠和关键的结构相似性分为DDE转座酶、DEDD转座酶、HUH转座酶和丝氨酸转座酶[10]。

自1950年由McClintock[11]发现转座子以来，随后在细菌、真菌及动植物中也被陆续发现，且被广泛研究。近年来，在原核转座子，如Tn5、Tn10、噬菌体MuA[12,13]，真核转座子家族，如hAT[14]、Tc1/Mariner[15]中的DDE转座酶已被广泛研究，DDE转座酶是由天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）三个保守的氨基酸三联体组成，显示了较好的应用前景。Halomonassp.中的ZM3转座酶可以使细菌适应恶劣环境条件的遗传信息[16]。Streptococcus agalactiae中DDE转座酶可通过改变整合位点上相邻基因的表达或促进基因组重排来改变其行为，能动态调节毒力基因，提高了它的适应能力[17]。TN转座子家族可以使用DDE转座酶进行复制转座，以产生共整合结构，在稳定相关转座子方面发挥作用[18]。Philippe等[19]通过计算机辅助比对和定点突变技术，发现并证明了在DDE转座酶上有一个螺旋-转角-螺旋（HTH）潜在的DNA结合域与催化结构域，可以使DDE转座酶蛋白形成聚合体，负责DNA结合的序列特异性，在调控基因表达中起着重要的作用。本文从X1链霉菌中克隆出DDE转座酶基因，并对其进行了生物信息学分析研究，以期为研究该转座酶的结构和功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

本文链霉菌是由实验室保藏菌株[20]，大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21，pET-32a(+)质粒均为实验室保存，pMD19-T载体购自大连宝生物有限公司。

1.1.2 培养基

LB培养基（g/L），高氏一号培养基（g/L），生理生化培养基配置方法见《微生物学实验技术》[21]。

1.1.3 酶与试剂

柱式DNA胶回收试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司，DNAMarker、FastPure质粒提取试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司，QuickCutTMEcoRI（15 U/μL）、QuickCutTMHind III（15 U/μL）均购自大连宝生物工程有限公司，Taq DNA polymerase（5 U/μL）购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海洋放线菌的生理生化鉴定

形态观察：采用平皿插片法，用美蓝染液染色后油镜下观察菌株的形态特征。碳源的利用、硫化氢产生等生理生化试验参考《微生物学实验技术》[21]。

1.2.2 放线菌16S rDNA鉴定[22]

将培养3～4 d的链霉菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，采用16S rDNA通用引物（27F，1492R）进行PCR扩增。将得到的序列用柱式DNA胶回收试剂盒回收后进行测序。将测序后的序列用SeqMan进行序列拼接后，利用EzTaxon数据库进行序列比对，初步得到该菌种种属，利用MEGA 5.0软件构建NJ系统进化树，得到亲缘关系最近的菌种。

1.2.3DDE转座酶基因扩增及蛋白表达

参考GenBank核酸数据库中已发布DDE转座酶基因序列（登录号：CP047144.1），设计上下游引物，并在5′端增加Hind III和EcoR I的酶切位点及保护碱基：

将扩增后的产物进行回收后，与pMD19-T载体连接转化DH5α感受态细胞，提取阳性重组质粒，将其送至北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

用HindIII和EcoR I双酶切阳性重组质粒及pET32a(+)质粒，回收目的片段及pET32a(+)酶切大片段，连接并转入BL21感受态细胞，挑取单菌落进行16 ℃诱导16～20 h后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

1.2.4DDE转座酶基因的生物信息学分析

通过Blast和ISfinder数据库确定该扩增序列为DDE转座酶基因片段；通过NCBI的ORF finder及ExPASy数据库对基因的ORF及氨基酸序列进行预测；通过蛋白性质预测网站对其拟翻译的蛋白质理化性质预测与分析；通过CBS Prediction Servers数据库提供的SignalP、TMHMM、DictyOGlyc、NetPhos等在线网站对其信号肽、跨膜结构区域、糖基化位点和磷酸化位点进行预测和分析；通过Sopma.html网站预测蛋白的二级结构；通过phyre2软件对蛋白质进行建模。

2 结果与分析

2.1 链霉菌的形态观察和生理生化试验鉴定

将筛选菌株X1涂布在高氏一号培养基上培养4 d，培养基表面呈灰褐色，菌落生长丰满，表面不光滑，呈馒头形，基内菌丝体的颜色为白色，且无可溶性色素产生。油镜（10×100）下观察可以看到菌株基内菌丝生长茂盛，呈直线不断裂，分枝多；孢子丝丛生、弯曲，孢子球形或椭球形，表面光滑，形成孢子链（图1）。

图1 油镜(10×100)下X1的形态Fig.1 Morphology of X1 under oil immersion lens (10×100)

不同的链霉菌能利用不同的糖，对X1进行不同碳源的利用实验时发现，X1可以利用葡萄糖、果糖、木糖、菊糖、甘露醇、麦芽糖、淀粉等糖，但不能利用蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、壳聚糖和柠檬酸。NaCl浓度低于10%时，菌体正常生长；NaCl浓度在10%～12.5%之间，菌体生长缓慢；NaCl浓度大于12.5%时，菌体受到抑制，不生长，由此看出，该菌对盐度的耐受性较强。其他生理生化实验结果显示，菌株X1可明胶液化；葡萄糖发酵实验中将紫色培养基变黄，说明菌株可以利用葡萄糖，但是在乳糖发酵培养基上没有颜色变化，则该菌不能利用乳糖；淀粉水解培养基上滴加卢戈氏碘液后有透明圈出现，说明可以水解淀粉；牛奶胨化实验中，X1能将牛奶先凝固后胨化；黑色素产生试验培养基上，28 ℃培养7 d，可发现培养基表面产生黑色物质，证明该菌可产生黑色素；但不产生硫化氢、不能将硝酸盐还原、不能将酪蛋白分解，也不能将纤维素进行水解。综合X1形态特征和生理生化特征，参考《伯杰细菌鉴定手册》[22]和《链霉菌鉴定手册》[23]，初步判断X1为链霉菌属灰褐类群。

2.2 16S rDNA 扩增及进化树的建立

以提取菌株的基因组DNA为模板，用16S rDNA的通用引物进行PCR扩增，得到单一且清晰的条带，该目的条带回收后测序。将测序结果用EzTaxon数据库比对，进行同源性搜索，结果发现，菌株X1与Streptomyces griseoincarnatus（AJ781321，99.93%）、Streptomyces labedae（AB184704，99.93%）以及Streptomyces violaceochromogenes（AB184312，98.86%）等有较高的相似性。在此基础上，选取与X1同源性较高的多条已知标准菌株的16S rDNA序列，利用MEGA5.0软件构建NJ系统进化树（图2），结果表明，在所选择的13个物种序列中，X1的16S rDNA与Streptomyces labedae相似度达到98%。从系统进化树分析，X1与Streptomyces labedae处于同一分支，同源性较高，这与生理生化结果一致，证明X1属于链霉菌属灰褐类群，并命名为Streptomyces labedaesp. X1。

图2 构建16S rDNA进化树Fig.2 Construction of 16S rDNA evolutionary tree

2.3 DDE转座酶基因序列分析

以X1基因组DNA为模板，特异引物D1、D2进行PCR扩增。当退火温度为61 ℃时能够扩增出一条单一清晰条带（图3），胶回收后，与pMD19-T载体连接转化DH5α感受态细胞，提取阳性重组质粒，酶切验证后，送北京六合华大基因科技有限公司进行测序。

图3 目的片断PCR电泳图Fig.3 PCR electrophoretogram of target fragment

2.4 DDE转座酶氨基酸结构分析

测序结果表明，该扩增片段为401 bp。利用Blast和ISfinder数据库进行序列比对（图4），发现其与ISAzo13家族转座酶基因有88%的相似度。

利用BlastX比对发现，该序列拟编码DDE转座酶，该区域中还包含一个Helix-turn-helix（HTH，螺旋-转角-螺旋）结构域，结果如图5。

转座酶的种类有很多，是生物体发生转座发生反应必不可少的作用元件，一直在被不断的探索[24]。Harmer等[9]在研究IS6/IS26家族时发现，该家族中的DDE转座酶具有三个保守的氨基酸三联体：天冬氨酸（D）、天冬氨酸（D）、谷氨酸（E）用于协调二价金属阳离子，这些阳离子在链断裂和重新结合期间发生的亲核攻击中起着至关重要的作用。此外还发现该DDE转座酶中有个HTH结构域，是具有二聚作用的结合结构，可以使DDE转座酶蛋白形成聚合体，是转座酶可能的DNA结合区[25,26]。Zou等[27]对金鱼Tgf2转座酶进行研究时，得到了三个保守的位点DDE（228aa、295aa、648aa），可以影响Tgf2转座酶的转座效率；DDE转座酶上的HTH结构域，是一个具有二聚作用的结合结构，除了起到结合DNA的作用外还起到了聚合作用，可以使Tgf2转座酶蛋白形成聚合体。结合对现有DDE转座酶的了解，对本研究的DDE转座酶的氨基酸序列进行分析，发现该DDE转座酶保守的氨基酸三联体分别位于Asp43、Asp49、Glu91。通过图5可以看出，该氨基酸序列中含有一个HTH结构域，且分析结果显示该结构域是转座酶可能的DNA结合区，是有效DNA转座所必需的。

2.5 生物信息学分析

2.5.1DDE转座酶基因的ORF预测

用NCBI的ORF finder检测这段序列的开放阅读框，结果表明该DDE转座酶基因的最大的ORF从第一个碱基开始，到第378个碱基终止，即所有序列基本都为编码区，可表达125个氨基酸。

2.5.2 DDE转座酶的理化性质分析

利用Protparam软件，分析链霉菌DDE转座酶的理化性质。该蛋白的氨基酸数量是125个，理论等电点pI：10.01，为 碱 性 蛋 白，分 子 式 为C634H1050N192O187S3，在280 nm波长下，所有半胱氨酸形成胱氨酸（cystines）时的消光系数为3105 L/(mol·cm)，对应的吸光度为0.215；所有半胱氨酸均不形成胱氨酸时的消光系数为2980 L/(mol·cm)，对应的吸光度为0.206；脂肪族氨基酸指数为91.74，GRAVY值为-0.283，不稳定指数为28.97小于40，表明该基因翻译出来的DDE转座酶为稳定蛋白。

2.5.3 DDE转座酶的亲/疏水性、跨膜结构分析

通过Protscale在线分析，预测DDE转座酶基因编码氨基酸序列的亲/疏水性（图6）。多肽链的第54位具有最大值1.944，疏水性最强；第25位存在最小值-2.900，为亲水性氨基酸。平均疏水性通过理化性质分析显示为-0.8645，在整条肽链中，亲水氨基酸数量较多，表明整条多肽链表现为亲水性，推测该蛋白为可溶性蛋白。

图4 DDE转座酶基因序列比对Fig.4 Sequence alignment ofDDEtransposase gene

图5 氨基酸结构域分析Fig.5 Amino acid domain analysis

图6 DDE转座酶基因编码蛋白的疏水性和亲水性Fig.6 The hydrophobicity/hydrophilia ofDDEtransposase gene coding protein

跨膜区必须由强疏水的氨基酸组成，才能使膜蛋白穿过膜的磷脂双分子层。通过蛋白亲、疏水性分析发现，该蛋白为亲水性蛋白，推测不存在跨膜区[28]。进一步利用TMHMM程序对该蛋白跨膜区进行了分析，结果如图7所示，表明确实不存在跨膜区，这与亲水性的分析的结果是一致的。

图7 DDE转座酶基因编码蛋白的跨膜区预测结果Fig.7 The transmembrane domain ofDDEtransposase gene coding protein

2.5.4 信号肽分析

图8 DDE转座酶基因编码蛋白的信号肽预测结果Fig.8 The signal peptide ofDDEtransposase gene coding protein

信号肽是引导前体蛋白质通过细胞膜分泌到胞外的一段序列，对其预测和分析有助于了解蛋白质的细胞定位并区分蛋白质的功能域[29]。信号肽预测结果如图8，分析发现该拟表达的蛋白中信号肽、TAT信号肽、脂蛋白信号肽存在的可能性分别为0.0058、0.0025和0.0026，说明该蛋白不存在信号肽，为非分泌蛋白。

2.5.5 糖基化与磷酸化位点分析

蛋白的糖基化与磷酸化一样都是最为普遍的一种蛋白质翻译后的修饰方式，肽链中的酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸是蛋白质磷酸化最容易形成的三种氨基酸[30]，利用NetPhos在线软件对该基因编码的蛋白磷酸化位点进行预测和分析（图9）。结果表明，该蛋白可以发生磷酸化的位点有14个，其中丝氨酸有四个，苏氨酸10个，且在多肽链中分布不均匀。

图9 DDE转座酶磷酸化位点预测与分析Fig.9 Phosphorylation site prediction and analysis of DDE transposase amino acid

糖基化有调节蛋白质功能作用,它是在酶的控制下，在蛋白质上加上糖类的过程。糖基化是对蛋白的重要的修饰，有调节蛋白质功能作用[31]。利用DictyOGlyc在线工具预测和分析DDE转座酶基因拟表达蛋白糖基化位点，结果如图10。

图10 DDE转座酶蛋白糖基化位点预测Fig.10 The prediction protein glycosylation site of DDE transposase

从分析结果可以看出，DDE转座酶基因拟表达蛋白上潜在的糖基化位点有1个，在第117位的丝氨酸上，说明该分析说明糖基化位点较少。

2.5.6 二级结构与三级预测

DNA序列翻译成氨基酸之后，可通过折叠和盘绕，形成比较稳定的空间结构，具有特有的生物活性和理化性质[32]。因此，蛋白质二级结构的预测和分析对我们了解蛋白的空间结构有重要的意义。对其空间结构的了解有着重要意义预测。常见的二级结构元件主要有结果如图11所示，该蛋白中存在68个α-螺旋占51.52%、15个β转角占11.36%、5个伸展占3.79%、44个无规则卷曲占33.33%。

图11 DDE转座酶基因编码蛋白的折叠盘绕方式Fig.11 The folded and coiled ways of DDE transposase gene coding protein

用蛋白质预测软件phyre2对氨基酸序列同源建模得到蛋白质的三维结构，如图12所示。该蛋白结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主，该结构较为简单，从图中可以看出，整体的结构是螺旋-转-螺旋（HTH）结构，预测其为DDE转座酶超家族，与已发现的HTH结构域基本一致[19]，这些结构对其生物学功能的发挥有重要作用。

图12 DDE转座酶基因编码蛋白的三级结构Fig.12 The tertiary structure of DDEtransposase gene coding protein

2.6 DDE转座酶基因的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

选取成功构建的pET32a(+)-DDE阳性表达质粒的单克隆菌接种到低盐培养基进行培养，当OD 600=0.6时，停止培养。加入IPTG使反应终浓度到达0.5 mmol/L时，培养17 h后取样，样品处理后用SDS-PAGE进行检测，结果如图13。

由图13可知，作为对照的pET32a(+)-DDE的菌株在未加入IPTG时，没有目的蛋白的表达；在加入IPTG低温诱导表达17 h后，在27 ku左右出现明显的条带，这与先前在线分析得到的预测的理论值相似，对以后鉴定DDE转座酶活性以及它的结构和功能奠定基础。

图13 DDE转座酶表达产物的SDS-PAGE分析Fig.13 SDS-PAGE analysis of DDE transposase expressed product

3 结论

3.1 本研究主要从实验室保藏菌株中筛选了一株产DDE转座酶的菌株，通过形态及生理生化鉴定，发现该菌与Streptomyces labedae有很近亲缘关系，相似度高达98%，将其命名为Streptomyces labedaesp. X1。从该链霉菌中克隆了DDE转座酶基因，该基因片段为401 bp，通过Blast和ISfinder数据库进行序列比对，结果显示其与ISAzo13家族转座酶的基因有88%的相似度。通过用ISfinder等软件对其氨基酸序列进行研究，发现该DDE转座酶的三个保守氨基酸分别位于Asp43、Asp49、Glu91，而且还存在一个HTH结构域，分析结果显示该结构域是转座酶可能的DNA结合区，是有效DNA转座所必需的。

3.2 研究发现已知蛋白的新功能，对蛋白的开发利用有巨大意义。本文通过对DDE转座酶基因进行生物信息学分析，理化性质结果显示，该基因拟编码蛋白的不稳定指数为28.97小于40，所以该蛋白为稳定蛋白，平均疏水性分析结果为-0.8645，所以是亲水蛋白。二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主，不存在信号肽和跨膜结构域，为非分泌蛋白；有14个磷酸化位点且仅有一个糖基化位点；该蛋白三级结构较为简单，主要为无规则卷曲和螺旋结构，而这些结构对其生物学功能的发挥有重要作用。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果显示在27 ku处出现条带，说明该基因可以表达成蛋白质。这些性质及结果分析对研究该基因及其家族的结构和生物学功能奠定了理论基础。但是为了获取更准确的研究结果，仍须克隆验证以及酶学鉴定，因此关于该基因的分子克隆和功能鉴定，我们还在进行更深层次的试验和研究。