中药单体成分抗白念珠菌实验的研究进展

谢凌峰， 贺莉雅， 王献哲， 严佳宝， 袁娟娜， 范瑞强， 谢婷

1.广东省中医院皮肤科，广东 广州 510120；2.广州中医药大学，广东 广州 510006

白念珠菌(Candidaalbicans)是一种临床常见的条件致病菌，近年来因为激素、生物制剂的广泛应用，以及癌症、HIV和糖尿病发病率升高等，患者免疫力下降，白念珠菌发病率不断升高[1-3]。而随着抗真菌药物在临床的大量使用，白念珠菌临床耐药性的问题也日渐突出，现在常见的抗真菌药物面临耐药、治疗周期长和肝肾毒性等问题[4]。中药单体成分有良好的抗真菌作用，且具有毒副作用小、来源广泛、较少出现耐药等优点，可以在抗白念珠菌中发挥重要作用。

中医认为白念珠菌感染引起的疾病有外因和内因两种，外因由寒湿袭表、湿郁蕴热、湿热阻滞肌表所致；内因由脾肾亏虚、内生湿浊、蕴而生虫所致。临床常用具清热、祛湿、杀虫、补益脾肾等功效的药物。中药单体成分是通过精油提取、乙醇提取、酸水溶液提取、超声提取等方法，从中药中提取得到的主要有效成分之一。本文综述中药单体成分抗白念珠菌实验研究进展。

1 清热药

1.1 小檗碱

黄连、黄柏具有清热燥湿的功效，小檗碱是其主要有效成分之一，因提取时常用盐酸提取，又叫盐酸小檗碱，具有广泛的抗菌作用。早期的体外实验显示盐酸小檗碱对白念珠菌浮游菌的MIC值平均为32 μg/mL[5]。白念珠菌的毒力与其形成菌丝、细胞形态转化以及细胞壁完整性密切相关，杨玉等[6]发现盐酸小檗碱在64～512 μg/mL时可以降低白念珠菌菌丝代谢；在256～512 μg/mL时可以抑制白念珠菌形态转化；512 μg/mL以上则可以明显破坏白念珠菌细胞壁完整性；通过实时荧光定量技术发现，小檗碱可以下调白念珠菌形态转化相关基因ECE1的表达水平2.72倍；还可以降低β-葡聚糖合成酶调控相关基因FKS1和FKS2的表达，暴露β-葡聚糖进而破坏细胞壁完整性。雍江堰等[7]发现盐酸小檗碱和氟康唑对抑制白念珠菌具有协同作用，通过免疫荧光标记法、流式细胞技术观测白念珠菌Ca2+内流情况，发现联用组、小檗碱组可以观测到Ca2+内流现象，而氟康唑组、空白组无该现象，分析小檗碱抗白念机制可能与盐酸小檗碱破坏白念珠菌的细胞内钙离子稳态有关;进一步通过qRT-PCR技术，检测发现联用组菌株的基因YVC1表达量比盐酸小檗碱组和氟康唑组分别高1.62倍、6.74倍，联用组和盐酸小檗碱组菌株的钙泵相关基因PMC1表达下调，而氟康唑组表达上调，提示其协同机制与影响基因YVC1、PMC1的表达相关。

1.2 黄芩苷

黄芩具有清热燥湿的功效。黄芩苷是源于黄芩的黄酮类化合物，常用水提法提取，对多种细菌、真菌、病毒都有抑制作用。早期的研究按照M27-A方案测定黄芩苷对白念珠菌MIC为1 mg/mL[8]。XTT法检测黄芩苷对白念珠菌生物膜活性影响，结果显示黄芩苷在8 mg/mL时可以使白念生物膜活性和生物量分别减少(90.6±5.2)%和(90.3±2.6)%[9]。采用流式细胞技术检测出黄芩苷可以提高白念珠菌浮游菌的凋亡率，利用同位素标记法测定前体3H-UdR、3H-TdR和3H-leucine，可发现白念珠菌浮游菌对这三种前体的摄取效率下降，提示其DNA、RNA和蛋白质合成下降，进一步测定其琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性，发现黄芩苷诱导白念珠菌浮游菌凋亡机制可能与降低其活性有关[10]。有实验发现加入黄芩苷后白念珠菌生物膜的凋亡率升高，其机制与活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)升高、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)下降、细胞色素C由线粒体释放入细胞质有关，进一步分析其中Ras-cAMP-PKA通路相关基因的表达水平，结果显示RAS1、TPK1表达上升，CAP1、PDE2表达下降[11]。黄芩苷与氟康唑联用抗白念珠菌浮游菌的FICI均值为0.41之间，对白念珠菌生物膜形成的FICI介于0.16～0.5之间，黄芩苷联合氟康唑使黏附相关基因ALS1、ALS3、EAP1、SUN41和CSH1的表达分别下调6%、51%、24%、13%和39%[12]。

1.3 苦参碱

苦参具有清热燥湿、杀虫的功效；山豆根具有清热解毒的功效，通过醇提法和酸提法从苦参、山豆根提取的中药单体成分苦参碱是其主要活性成分之一，具有多种药理作用。SHAO等[13]通过微量稀释法测定苦参碱MIC80为1 mg/mL，苦参碱与氟康唑联用具有协同作用(FICI=0.197)；通过Spider培养基培养，观察白念珠菌菌丝生长,发现1 mg/mL苦参碱可以抑制白念珠菌菌丝生长，进一步通过qRT-PCR技术，发现苦参碱可以使菌丝形成相关基因ALS3、SUN41和PBS2下调29%、45%和61%。

1.4 穿心莲内酯

穿心莲内酯是从清热解毒类中药穿心莲中提取的二萜内酯类化合物，具有消炎抗菌、抗病毒、免疫调节等多种作用。穿心莲内酯可以抑制黏附基因ALS3、EAP1表达水平，从而抑制白念珠菌早期(2 h)的黏附作用，但对基因ALS1的表达水平具有促进作用[14]。施高翔等[15]研究穿心莲内酯对白念珠菌生物膜分散的影响，结果显示穿心莲内酯在250～1 000 μg/mL能剂量依赖性诱导白念珠菌生物膜分散，进一步研究发现，穿心莲内酯可以提高促分散基因HSP90表达，同时抑制抗分散基因UME6表达，虽然在该研究中另一个促分散基因PES1表达受到抑制，但穿心莲内酯总体发挥促白念珠菌生物膜分散的效应。

2 祛湿药

2.1 汉防己甲素

粉防己又叫汉防己，是防己科植物，具有祛湿祛风的作用。汉防己甲素是来自于粉防己根部的生物碱，具有广泛的药理活性。在体外实验中，汉防己甲素对氟康唑抗白念珠菌生物膜的最初期(0 h)、早期(4 h)有增效作用；而中期(24 h)、成熟期(48 h)无增效活性[16]。动物实验发现汉防己甲素在91 mg/kg时对系统性白念珠菌感染小鼠具有治疗作用，其机制与调节细胞免疫有关[17]。汉防己甲素与氟康唑在抑制播散性小鼠模型中白念珠菌感染具有协同作用(FICI<0.05)，且在CDR1/CDR2、MDR1过表达的菌株中，两者协同作用表现更强，提示其抗耐药机制可能与白念珠菌转运功能有关[18]。

2.2 土槿乙酸

中药土槿皮具有祛湿、杀虫的功效。土槿乙酸(PAB)是其主要有效成分之一，具有抗菌作用。土槿乙酸对白念珠菌MIC为32～128 μg/mL，且与氟康唑联合抗白念珠菌有协同作用(FICI<0.05)[19]；对白念珠菌出芽生长和生物膜形成过程有抑制作用(SMIC50为256～512 μg/mL)[20]。刘丽英等[21]通过HPLC法测定白念珠菌细胞膜中麦角淄醇含量，结果显示PAB抑菌活性机制为抑制真菌的麦角甾醇生物合成。在槿乙酸增加油相和表面活性剂之后得到PAB-ME凝胶，体外实验和白念珠菌感染豚鼠的体内实验中均表现出抗真菌活性[22]，为临床应用提供依据。

3 其他

3.1 大蒜素

大蒜素是百合科植物，具有抑菌、杀菌等作用，是自然界中的植物广谱抗菌素。中医认为大蒜具有解毒杀虫的作用，其有效成分是大蒜素。CLSI-M27-A3微量液基稀释法检测显示大蒜素对白念珠菌的最小抑菌浓度为25 μg/mL，通过倒置显微镜观察大蒜素对Spider培养基中白念珠菌形成的影响，同时用qRT-PCR法检验其相关基因表达水平变化，发现大蒜素在25～100 μg/mL浓度能有效抑制白念珠菌形态转化，其作用机制可能与相关基因HWP1、ALS1、EFG1、PDE2表达水平有关[23]。XTT法检测显示大蒜素对白念珠菌生物膜的SMIC80为64～256 μg/mL，且白念生物膜相关基因ALS1等表达均下调[24]。体外实验发现大蒜素和制霉菌素在对白念生长的抑制中有协同作用(FICI≤0.5)[25]。在白念感染免疫抑制小鼠的体内实验中，利用双抗体夹心ELISA法检测发现大蒜素可以提高小鼠体液中IgG、IL-4、IL-12的水平[26]，增强免疫抑制小鼠的免疫功能，增加机体抗白念珠菌的能力，为临床研究提供参考。

3.2 丁香酚

丁香具有补肾助阳的功效，丁香酚是丁香提取物丁香精油的主要有效成分[27]，具有消炎、抗菌的作用。高原等[28]通过二倍稀释法、XTT法测定丁香酚对白念珠菌的MIC为1.64 mg/mL，对白念珠菌作用24 h的SMIC50为9.80 mg/mL。丁香酚与氟康唑对抑制浮游型白念珠菌有协同作用(FICI=0.313)[29]；与两性霉素B对抗白念珠菌具有协同作用(FICI=0.27)，其机制可能与细胞质中细胞色素C的增加，细胞内钙离子浓度上升等诱导细胞凋亡因素相关[30]；对临床分离的氟康唑耐药白念珠菌具有逆转耐药的作用，在第7～8代恢复对氟康唑敏感[31]。

3.3 白藜芦醇等

白藜芦醇可以诱导白念珠菌细胞凋亡，其机制可能与提高细胞内ROS水平和降低MMP水平有关[32]。紫檀芪通过聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒搭载时对白念珠菌生物膜BMIC50为16 μg/mL，其抑制生物膜活性高于游离的PTB[33]，提示搭载合适的载体后，可以增强有效成分对白念珠菌的抑制作用[34]。

芒果苷与氟康唑对抗白念有协同作用(FICI<0.2)，其机制与下调白念珠菌外排泵相关基因CDR1、MDR1的表达有关[35]。

肉桂醇对白念珠菌的MIC为160～320 μg/mL，与氟康唑具有协同作用(FICI=0.375)，进一步实验检测发现肉桂醇与氟康唑合用可以减少白念珠菌毒力因子磷脂酶B的释放，机制与下调其调控基因PLB1表达有关[36]。

4 中药单体成分抗白念珠菌机制

白念珠菌的凋亡受许多因素的影响。线粒体是为细胞供能的重要细胞器，SDH是三羧酸循环中唯一与线粒体内膜结合的酶，可以在一定程度上反应细胞的能量供应能力，中药单体成分黄芩苷加入后，白念珠菌的SDH活性下降，细胞功能受损，但目前的研究表明黄芩苷对呼吸链中心酶——细胞色素C氧化酶(cytochromec oxidase,COX)影响不显著。ROS水平、MMP水平变化是白念珠菌凋亡的早期表现，若MMP消耗殆尽则其凋亡则无法逆转，黄芩苷、白藜芦醇均可使ROS水平上升，MMP水平下降[11, 32]。Ras/cAMP/PKA途径不仅在白念珠菌的生长凋亡中起关键调控作用，对其生物膜形成、毒力也有重要影响[37]。黄芩苷可以使Ras/cAMP/PKA途径相关基因RAS1、TPK1表达上升，CAP1、PDE2表达下降[11]。内环境离子稳态对细胞活性至关重要，Ca2+-Mg2+ATP酶可以通过将细胞内多余的Ca2+泵到细胞外来维持细胞稳态，黄芩苷加入后可以下调Ca2+-Mg2+ATP酶活性，从而破坏离子稳态使白念珠菌坏死[10]。土槿皮乙酸则可以发挥类似吡咯类药物的作用，减少白念珠菌细胞膜上麦角脂醇含量[20]，但其上游机制是否与14α-去甲基化酶(14DM)相关尚未得到深入研究。

白念珠菌的形态转化、生物膜形成与黏附、菌丝形成和细胞壁功能相关。白念珠菌的孢子或浮游菌的黏附是形成生物膜的起点，体外实验中，黄芩苷可以抑制白念珠菌对口腔上皮细胞和阴道上皮细胞的黏附能力，黄芩苷、苦参碱和大蒜素可以抑制白念珠菌黏附相关基因ALS1、ALS3、ALS4、SUN41、EAP1、CSH1的表达[12-13, 38]。黏附后可形成芽孢酵母的微菌落，而出芽形成菌丝，由酵母相向菌丝相转化是白念珠菌增强毒力的关键。小檗碱、苦参碱可以下调菌丝形成相关基因ECE1、ALS3、SUN41和PBS2[13]。细胞壁不仅可以维持细胞形态，还参与白念珠菌的黏附和毒力因子的释放，小檗碱可以破坏细胞壁的完整性。在胞外聚集基质中，菌丝相和酵母相细胞构建起一个复杂的三维结构，白念珠菌由浮游菌向生物膜完成形态转化，形成白念珠菌生物膜后，其毒力和耐药性都会提高。穿心莲内酯则可以促进白念珠菌生物膜分散至浮游菌状态[15]。

在细胞形态转化过程中，白念珠菌的耐药能力不断增强，其耐药性与抗菌药结合位点的表达、外排泵转运药物能力和细胞器膜转运离子能力相关。白念珠菌外排泵主要受两种类型基因调控，一种为ATP依赖型CDR1和CDR2；另一种则是质子交换型MDR1和FLU1;芒果苷可以下调两种基因的表达[35]。因为在形成生物膜的早期，外排泵的能力对耐药性影响较大，所以有研究推测只在形成生物膜的早期和中期对氟康唑有协同作用的汉防己甲素的作用位点在外排泵上[16]。

液泡是白念珠菌内储存Ca2+的主要细胞器，液泡膜上钙离子调节器/通道蛋白Pmclp Vcxlp可以将细胞质内Ca2+转运至液泡中；调节器Yvcxlp则可以将Ca2+从液泡转运至细胞质，氟康唑可以抑制Vvcxlp的功能打破白念珠菌Ca2+稳态达到抗菌目的，但白念珠菌高表达Pmclp时则可以代偿被抑制的调节器Vcxlp的功能从而对氟康唑耐药[39]，中药单体成分小檗碱不仅可以下调基因PMC1表达，抑制Pmclp转运能力，还能上调基因YVC1表达，促进Yvclp向内转运Ca2+与氟康唑发挥协同抑菌作用[7]。抗真菌药物在白念珠菌上的结合位点通常是麦角脂醇及其上游调节酶，EGR11基因编码14DM的构象，当它发生突变时，白念珠菌因无法被吡咯类药物结合而形成耐药。目前针对EGR11基因表达的中药单体成分研究较少，尚有待进一步深入。

5 结语

白念珠菌的常规抗真菌治疗方法常面临肝肾损害、耐药和可选择药物较局限等问题的困扰，中药单体成分与氟康唑、两性霉素B等抗真菌药物对耐药标准株有协同作用，能降低其MIC，并可能对临床耐药菌有逆转耐药的作用。中药单体成分的抗白念珠菌机制与抑制菌丝形成、阻滞白念珠菌形态改变、破坏细胞壁完整性和改变胞内离子稳态有关。在体内实验中，中药单体成分能提高免疫抑制型小鼠的IgG、IL-4、IL-12水平，增强其免疫力进而抗击白念珠菌。中药单体成分抗白念珠菌具有许多优势，且中药单体成分丰富多样、来源广泛，对白念珠菌的临床治疗有重要意义，但很多机制尚未完全明确，有待于进一步深入研究。