增强光动力治疗肿瘤的应用研究进展

李丹丹， 于波， 叶庭路

1.安徽医科大学北京大学深圳医院临床学院; 2.北京大学深圳医院皮肤性病科，广东 深圳 518036

光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)是一种以光敏剂、氧分子及光源相互结合的一种治疗方法，是肿瘤治疗的一种有前景的疗法。PDT其原理是光敏剂被代谢活跃的肿瘤细胞优先吸收后，应用适当的光源照射刺激靶细胞让其产生单线态氧及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，直接杀伤肿瘤细胞，以及激活靶细胞的抗肿瘤免疫应答来诱导细胞凋亡。PDT治疗后血管闭塞导致的肿瘤细胞的缺氧，也参与了肿瘤病灶的清除。PDT作为肿瘤治疗的新兴疗法，与手术及放化疗相比有很多优势,如相对非侵入性治疗、对肿瘤选择性较好、毒性及耐药性低、能治疗多种肿瘤且重复治疗疗效较好、操作方便及副作用小等。但PDT治疗肿瘤目前还存在许多不足之处，包括：①肿瘤微环境中氧的缺乏；②光敏剂的局部生物利用度不足；③光源及光敏剂的穿透深度不够；④肿瘤的免疫逃逸等。这些缺陷可能减弱PDT杀灭肿瘤细胞的疗效，以及限制PDT在一些肿瘤浸润程度较深的病灶上的应用。目前，现已有很多研究针对光敏剂与光源、药物与PDT联合治疗，以及PDT介导的免疫效应方面进行改良，旨在提高PDT在抗肿瘤方面的疗效。

1 光敏剂的改良

光敏剂在PDT治疗中能够被靶组织吸收后在特定的波长激发光下产生ROS，从而破坏该靶细胞，甚至直接导致细胞死亡。目前为止，光敏剂的发展主要经历了三代，从以血卟啉衍生物为代表的一代光敏剂到现在的一些具有药物传输系统的三代新型功能型光敏剂，无论是从疗效、毒性、理化性质等方面都有了很大的改善。

1.1 光敏剂提高肿瘤微环境中的氧

在对肿瘤进行PDT治疗过程中肿瘤微环境的缺氧是阻碍疗效的重要原因之一，包括直接向肿瘤组织输送氧气以及原位反应间接供氧等多种方法已用来改善肿瘤治疗过程中微环境的缺氧。研究发现肿瘤组织内含有过氧化氢并且其含量高于周围正常细胞[1]。细胞内含有天然的过氧化氢酶能够将其分解产生氧气，但催化反应因体内环境影响并不稳定。Dan等[2]构建了负载光敏剂吲哚菁绿的超小金纳米颗粒，该纳米颗粒被证实能够在肿瘤组织高度聚集，并且具有高效过氧化氢酶功能，较大程度上改善了肿瘤微环境中的供氧，从而进一步提高PDT治疗肿瘤的疗效。将能够产生氧气的化学物质与光敏剂一同负载在新型材料载体水凝胶上亦能改善PDT疗效。Hou等[3]合成一种生物相容性的琼脂糖基水凝胶，该水凝胶包含了光敏剂二氢卟吩e6、腐植酸钠和氧化锰。在PDT的光照下，局部温度的升高可以促进水凝胶中的光敏剂以及氧气的释放，从而缓解肿瘤微环境的缺氧，使得肿瘤生长抑制率达到了93.8%。

1.2 光敏剂促进PDT抗肿瘤免疫效应

PDT的抗肿瘤免疫效应，是肿瘤经PDT处理后促进机体免疫识别肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原而产生相应免疫应答，进一步攻击和清除肿瘤细胞、抑制肿瘤的生长。免疫佐剂是同抗原一起或预先注入机体内,能增强机体对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的辅助物质，在光敏剂中加入免疫佐剂后再进行PDT治疗能够增强机体对PDT后产生的肿瘤相关抗原的免疫应答。在含光敏剂的纳米粒中加入免疫佐剂CpG后能够促进树突状细胞成熟，从而促进PDT后的抗肿瘤免疫效应[4]。将CR276抗体与光敏剂IRDye700偶联后对皮下肿瘤进行PDT治疗，可发现其抑制肿瘤的生长及转移效果优于其他对照组，并且在该联合光敏剂介导的PDT治疗后,肿瘤组织内的CD11c+CD83+双阳性的成熟DC细胞的数量较对照组增加，以及CD8+T细胞数量也显著增加[5]。表明通过这些免疫细胞的成熟和数量的增加进一步增强了PDT的抗肿瘤免疫效应。

1.3 直接作用于关键信号通路光敏剂的应用

PI3K/Akt信号通路是人类癌症中最频繁被激活的信号通路之一，阻断该通路成为治疗肿瘤的一个有效治疗方法。目前已有针对该通路抑制剂的临床研发。Li等[6]合成了硫掺杂碳点(S-CDs)作为纳米光敏剂，S-CDs介导的PDT被证实能够有效抑制与肿瘤细胞存活相关的PI3K/Akt信号通路，并能促进与细胞凋亡相关的p38/JNK通路。

1.4 提高光敏剂的肿瘤选择性

肿瘤组织对光敏剂有一定的选择性，具体机制目前仍不清楚。可能与肿瘤组织对光敏剂的代谢以及肿瘤细胞较正常细胞有更多的低密度脂蛋白受体,能够介导光敏剂进入肿瘤组织细胞内有关。近年来为了提高光敏剂的靶向性，研究者们开发了肿瘤微环境响应型纳米材料，这类纳米材料主要有pH响应型、氧化还原响应型、乏氧响应型、酶响应型等，能够响应肿瘤微环境中不同的特性从而在肿瘤组织靶向释放光敏剂。Yan等[7]制备了负载酞菁类光敏剂的pH响应型纳米材料，该纳米药物在酸性条件下如肿瘤微环境中能特异性释放光敏剂,而在正常生理环境中则具有较高的稳定性。另外,此种光敏剂还加有叶酸的修饰，能够与肿瘤表面过表达的叶酸受体相结合。因此,这类改良的光敏剂能高度选择性地被输送至肿瘤部位,从而提高PDT治疗肿瘤的高效性与特异性。

2 光源的改良

临床上PDT的光源主要有广谱灯、激光器以及发光二极管(light-emitting diode，LED)等。LED作为光源因其发光波长的多样性能与不同光敏剂的吸收光谱所匹配。此外，LED光源还具有较好的发光效率、输出功率和稳定性。LED光源较普通的激光光源具有多波长选择性、适用于体表大面积照射、成本低、便携耐用等优势。为了提高PDT临床治疗的精准性与便携性，可穿戴式、可植入式的PDT治疗光源已成为未来PDT光源的研究方向之一。Fonda-Pascual等[8]运用可穿戴式的帽状低能量光疗作为PDT的光源，对头皮AK进行治疗。该帽状光源内置246个大功率非聚焦LED,在给患者治疗区域涂抹光敏剂氨基乙酰丙酸甲酯乳膏后,即将该设备戴在患者头上。治疗后对患者进行随访,发现AK较之前基线水平有所改善。

上转换发光材料是一类能将红外低能光子转换为紫外或可见高能光子的发光材料。因其所吸收的光子能量低于发射的光子能量，故称为上转换发光。近年来研究者开发出了激发波长位于600～1 100 nm的上转化纳米粒子(upconversion nanoparticles，UCNPs)。UCNPs可作为PDT的能量传递体将组织穿透深度较深的近红外光转换为可用于激发光敏剂的紫外或可见光，这使PDT中光源具有更好的生物组织穿透性，进一步增加光敏剂在体内产生ROS从而提高PDT疗效。Li等[9]研制出一种用于细胞内组织蛋白酶B响应型PDT的上转换纳米探针，该探针中UCNPs将近红外光转换后再将540 nm处的发射能量转移到成像染料Cy3，并通过Cy3与UCNPs的荧光强度比来进行PDT的自校正疗效预测功能。这种纳米探针为PDT治疗肿瘤提供了高效及精准的光源。

近年来出现了无外部激发光的PDT治疗。Singh等[10]合成了一种化学动力学纳米颗粒CDNP，其中过氧酸所降解所产生的能量能够激发光敏剂，从而进一步产生单线态氧来杀灭癌细胞。这种PDT治疗肿瘤无需外界光线的介导，治疗深度能够不受传统PDT光源的限制。

3 PDT联合药物治疗

3.1 PDT联合药物增加细胞内原卟啉Ⅸ的水平

盐酸氨酮戊酸(aminolevulinic acid hydrochloride,ALA)是细胞内合成血红蛋白的前体，其本身无光毒性，因此被称为内源性光敏剂。ALA经一些列酶的催化后在线粒体内转化为具有光敏活性的原卟啉Ⅸ(PpⅨ)，PpⅨ在氧的存在下被相应波长光激活后产生ROS破坏甚至杀死癌细胞。Anand等[11]将5-氟尿嘧啶(5-FU)与ALA-PDT治疗联合应用于小鼠鳞状细胞癌模型中，在5-FU预处理后再进行PDT治疗，发现这种联合治疗增加了PpⅨ水平的升高和肿瘤细胞的凋亡。在另外两项研究中还发现甲氨蝶呤(methylammonia,MTX)和骨化三醇联合PDT治疗也能够增加PpⅨ的产生，并且同时还能增强肿瘤细胞的分化。推测可能与血红素合成过程中关键酶的表达受到C/EBP转录因子调控有关，而MTX和骨化三醇又能通过调节C/EBP转录因子来影响肿瘤分化[12-14]。

3.2 PDT疗法联合药物治疗调节抗肿瘤免疫反应

激光免疫疗法是一种将免疫调节剂与PDT联合应用来增强PDT的抗肿瘤免疫效应的综合治疗方法。Cai等[15]将免疫调节剂糖化壳聚糖与光敏剂Photofrin介导的PDT联合应用于EMT6乳腺肿瘤和4T1转移性乳腺肿瘤的荷瘤小鼠，证实这种综合疗法能够更好地抑制肿瘤的生长、转移及活化免疫细胞。咪喹莫特是一类免疫调节剂，能够激活Toll样受体7和8来介导NF-κB的活化，进一步激活机体先天和获得性免疫来产生抗肿瘤作用。ALA-PDT与咪喹莫特联合应用于小鼠及人体皮肤鳞状细胞癌能够增强ALA-PDT的抗肿瘤效应。咪喹莫特通过调节免疫细胞的数量，促进促炎细胞因子及趋化因子的表达来调节PDT的抗肿瘤免疫效应[16]。

近年来发现PD-1/PD-L1抑制剂阻断免疫检查点协同光动力疗法治疗肿瘤取得了较好疗效。在一项实验中发现局部光动力疗法，Rho激酶(ROCK)抑制剂和PD-1/PD-L1免疫检查点阻断的三联疗法能够有效治疗原位葡萄膜黑素瘤并防止其转移。其中局部光动力疗法联合Rho激酶抑制剂发挥了类似癌症疫苗样的免疫原性清除作用，进而使CD8+T细胞被运输至原发肿瘤部位，并且激活PD-1/PD-L1 免疫检查点来引起全身的抗肿瘤免疫反应从而有效抑制了葡萄膜黑素瘤的转移[17]。Alvim等[18]通过血管靶向光动力疗法，PD-1抑制剂和OX40激动剂免疫疗法联合应用于尿道癌动物模型中,亦发现其能通过增强抗肿瘤免疫效应来抑制肿瘤生长。

早期有实验发现在硅酞菁4作为光敏剂治疗肿瘤时具有免疫抑制效应[19]，随后也相继有实验发现PDT治疗的免疫抑制作用。最近的研究表明PDT导致的免疫抑制效应可能是通过环氧合酶2型(COX-2)途径来上调调节性T细胞(Treg)和髓源性抑制细胞(MDSCs)，通过抑制上述两种细胞及COX-2可能会阻断这种免疫抑制效应从而提高PDT的疗效[20]。在小鼠鳞状细胞癌SCCVII肿瘤进行替莫卟吩介导的PDT后,即刻注射抗抗鼠GR1抗体能够阻断PDT疗效，然而在PDT后1 h注射可以提高肿瘤的治愈率，推测这种现象可能与能够增强PDT疗效的中性粒细胞在PDT后1 h内被具有免疫抑制作用的髓系调节细胞Mregs取代有关，而抗GR1抗体能够消耗这两种细胞，在不同时间段内注射所消耗的细胞种类不同,所以导致对肿瘤的治疗效果也不同[21]。与直接增强PDT的抗肿瘤免疫效应的药物一样，PDT联合能够减弱负性免疫调节作用的药物也是增强PDT治疗肿瘤疗效的一个重要的方向。

3.3 PDT疗法联合药物治疗促进或抑制肿瘤关键信号通路

MAPK通路是光动力介导的与肿瘤细胞凋亡相关的重要通路之一。将白藜芦醇(resveratrol,Res)联合ALA-PDT处理A431表皮样癌细胞，发现Res能够通过p38/MAPK通路进一步促进细胞凋亡来增强PDT对肿瘤细胞的杀伤作用[22]。Dickkopf3(Dickkopf3，DKK-3)是一类Wnt信号抑制因子，可能通过诱导caspase3和内质网应激相关的细胞凋亡抑制肿瘤细胞生长。将DKK-3与ALA-PDT联合应用于4T1乳腺细胞株后显著增加了癌细胞的死亡率[23]。

3.4 PDT疗法联合药物治疗靶向阻断肿瘤细胞特异受体

头颈部鳞癌的特征之一是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的过度表达，将选择性阻断EGFR和血管内皮生长因子受体-2的凡德他尼联合二氢卟吩e6介导的PDT应用于口腔鳞癌细胞株CAL-27的体外治疗，发现凡德他尼能够通过影响DNA的修复机制及肿瘤微环境从而增强PDT的疗效[24]。

4 PDT介导的肿瘤疫苗

肿瘤的免疫逃逸是肿瘤细胞能够在体内生存及增殖的一个重要因素，增强肿瘤细胞的免疫原性是使机体免疫系统能及时识别并通过天然和获得性免疫机制抵抗肿瘤的重要方法之一。肿瘤细胞经PDT处理后能够通过损伤相关分子模式(damage danger associated molecular patterns,DAMPs)释放各类细胞内分子来增强肿瘤细胞免疫原性，从而进一步激活机体抗肿瘤免疫应答[25]。PDT肿瘤疫苗则是将PDT治疗肿瘤细胞后得到的肿瘤细胞裂解物作为具有免疫原性的抗原来激发机体的抗肿瘤免疫效应。

Ni等[26]制备了一种能够诱导募集树突状细胞为主的肿瘤疫苗MC/Dox/Ce6。该疫苗以癌细胞膜CCM包裹纳米颗粒、盐酸阿霉素及光敏剂e6(Ce6)，其中小剂量的阿霉素的细胞毒性及Ce6介导的PDT能够导致免疫原性细胞死亡,以及产生肿瘤相关抗原来招募树突状细胞并促进其成熟,从而进行有效地疫苗接种来发挥抗肿瘤效应。在CT26荷瘤小鼠上以肿瘤靶向pH敏感的锌基免疫调节剂进行原位免疫接种，亦发现了PDT肿瘤疫苗的上述类似效果[27]。

ALA-PDT树突状细胞疫苗能够增加肿瘤局部及小鼠脾脏的CD4+及CD8+T细胞的活性和含量，也能够增加外周血及小鼠脾脏中的免疫相关细胞因子如白细胞介素12和干扰素-γ的含量[28]。ALA-PDT树突状细胞疫苗可能通过这些机制增强了小鼠全身抗肿瘤免疫效应，从而有效预防小鼠皮肤鳞癌的发生。

5 结语

PDT治疗肿瘤虽然已有很多的基础研究，但目前在临床治疗中尚处于起步阶段，仍有很多不足。已经有越来越多的研究从PDT最主要的三要素(光敏剂、氧及光源)、PDT的联合治疗和PDT的抗肿瘤免疫调节等方面对PDT治疗肿瘤方法进行改良，以增加PDT对肿瘤细胞的杀伤力并且尽量减轻其对正常组织细胞的损害。这些研究能为临床治疗提供理论基础，从而使PDT治疗有望成为继手术、放化疗治疗肿瘤的又一重要方法。