小檗碱纳米制剂的制备及表征研究

蒋蕾，孙旭，刘肖莹，高楚雅，丁匀乔，彭海生

（哈尔滨医科大学大庆校区药学院，黑龙江 大庆 163319）

黄连作为常用传统中药，具有清热泻火、燥湿解毒等功效，其主要活性成分为小檗碱，近年来对小檗碱的研究不断地深入，发现其在治疗心血管疾病、糖尿病、肿瘤、炎症及抗菌、抗病毒方面有多种药理作用［1］，常被用于治疗人体胃肠道炎症［2］。临床上多以小檗碱盐酸盐的形式应用，但是溶解度较低，并且小檗碱味道苦涩［3］，生物利用度低和潜在的副作用等，都限制了小檗碱更大范围的应用。因此制备小檗碱纳米粒以提高生物利用度和延长疗效是非常有必要，并且有意义的［4］。壳聚糖（chitosan，CS）是一种生物大分子，具有无毒、黏膜黏附等作用，带有大量的正电荷，能够与负电荷相互结合发挥作用［5－6］。有报道称，由于CS 能够改善消化系统中小檗碱的细胞旁途径，因此能够通过细胞旁途径增强小檗碱的吸收［7］。

纳米制剂能够有效控制药物的释放，相比其他药物剂型，此法能够避免药物的破碎降解，并且具有良好的靶向性［8］。林爱华等［9］也以壳聚糖为材料，采用离子凝胶法制备了小檗碱壳聚糖纳米粒，但为了工业化生产，笔者采用离子交联法进行小檗碱纳米制剂的制备，现报道如下。

1 材料

1.1 试剂

小檗碱（纯度≥97%，批号：J1202A，大连美仑公司）；壳聚糖（批号：C8320，索莱宝公司）；三聚磷酸钠（批号：B1926068，Aladdin 公司）；醋酸（分析纯，批号：20171116，辽宁泉瑞试剂）。

1.2 仪器

精密电子天平（赛多利斯有限公司）；粒径电位仪（Malvern instruments 公司）；磁力搅拌器（欧莱博公司）；紫外－分光光度计（南京菲勒仪器）；移液枪（德国Eooendorf公司）。

2 方法

2.1 小檗碱全波长扫描及标准曲线的制备

用紫外－可见分光光度计进行盐酸小檗碱的全波长扫描，测定其吸收最大值在340～430 nm 之间。精密称取小檗碱10 mg，定容至100 mL 容量瓶中，配制成0.1 mg/mL 的盐酸小檗碱标准储备液。分别精密量取100、500、800、1 000、1 200、1 500 μL 将其稀释至质量浓度为1.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 μg/mL，在345 nm 波长处测定各浓度下的吸光度值（A），以A 值对应的质量浓度（C）绘制标准曲线。

2.2 小檗碱与壳聚糖的比例对粒径的影响

称取20 mg的CS粉末缓慢溶于1%的醋酸中，配制成1 mg/mL CS－HAC溶液（pH值=5），通过0.45 μm的滤膜进行过滤，除去残余物。称取适量的盐酸小檗碱粉末于蒸馏水中，配成0.5 mg/mL 的盐酸小檗碱水溶液。通过磁力搅拌器将二者按照小檗碱/壳聚糖为1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的比例进行混合。称取适量的三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，STPP）固体粉末于烧杯中，配制成1.0 mg/mL STPP 溶液，缓慢地向溶液中滴加，搅拌30 min，测定各自纳米粒的粒径。

2.3 小檗碱纳米粒的制备

采用离子交联法制备壳聚糖－盐酸小檗碱纳米粒。称取20 mg的CS粉末缓慢溶于1%的醋酸中，配制成1 mg/mL CS－HAC 溶液（pH 值= 5），通过0.45 μm的滤膜进行过滤，除去残余物。称取适量的盐酸小檗碱粉末于蒸馏水中，配成0.5 mg/mL 的盐酸小檗碱水溶液。通过磁力搅拌器将二者混合。称取适量的STPP 固体粉末于烧杯中，配制成1.0 mg/mL STPP 溶液，缓慢地向溶液中滴加，搅拌30 min。通过Nano ZS90 型纳米粒度仪对小檗碱纳米粒进行粒径、PDI 及电位的测定。

2.4 小檗碱纳米粒的载药量和包封率

取适量制备好的壳聚糖盐酸小檗碱水分散体系纳米粒于EP管中，5 000 r/min超速离心20 min。在345 nm处测定上清液的吸光度（A）值。小檗碱纳米粒的包封率和载药量公式如下：

计算其包封率和载药量分别为90.91%、8.26%。

2.5 小檗碱纳米粒的体外释放

取2 mL 的壳聚糖－小檗碱纳米粒溶液于透析袋中，采用转篮法测定壳聚糖－小檗碱纳米粒的体外释放，其转速为110 rpm/min，温度为37 ℃，释放介质为含有1%FBS 的PBS（pH 值=7.4）溶液，采取等量原则分别在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 收集释放液2 mL。取出的释放液分别在波长345 nm 处测不同时间点的吸光度值。

2.6 小檗碱纳米粒稳定性的考察

经上述操作制备的壳聚糖－盐酸小檗碱纳米粒放在4 ℃冰箱避光保存，分别于第1、3、5、7、10、20、30 天测定其粒径，判断其稳定性。

3 结果

3.1 小檗碱全波长扫描及标准曲线的制备

小檗碱在345 nm吸收值较好，因此，在此波长下采用线性回归方程的方法绘制小檗碱标准曲线，测定其吸光度（A）值。结果，小檗碱在1.0～15.0 μg/mL 具有良好的线性关系，其标准曲线方程为Y = 0.016 9X +0.140 6，R2=0.998 5。见图1。

图1 小檗碱全波长扫描及标准曲线

3.2 小檗碱与壳聚糖的比例对粒径的影响

药物与载体的比例对壳聚糖－小檗碱纳米粒粒径的影响如图2所示，当药物与载体的比例为1∶1、1∶6时，未完全形成纳米粒，部分药物以溶液状态存在；当药物与载体的比例为1∶2、1∶4时，形成纳米粒，其中当药物与载体的比例为1∶4时，其粒径、PDI值较小，平均粒 径为（178.0 ± 11.4）nm，PDI 值为0.18 ± 0.09。见表2。

图2 小檗碱与壳聚糖的比例对粒径的影响

3.3 小檗碱纳米粒的粒径及电位

采用最佳药物与载体的比例制备盐酸小檗碱纳米粒，其粒径及Zeta 电位如图3 所示，其平均粒径为（184.8 ± 5.8）nm、PDI 值为0.17 ± 0.02、Zeta 电位为+（23.3±1.8）mV。

表1 小檗碱与壳聚糖的比例对粒径的影响（±s）

表1 小檗碱与壳聚糖的比例对粒径的影响（±s）

药物/载体1∶1 1∶2 1∶4 1∶6平均粒径（nm）618.6±10.5 306.8±9.3 178.0±11.4 450.4±6.9 PDI 0.91±0.13 0.32±0.06 0.18±0.09 0.48±0.11

图3 小檗碱纳米粒粒径及电位

3.4 小檗碱纳米粒的光学现象观察

由图4 可知，右侧给予一束光线后，左侧盐酸小檗碱溶液未看见一条光亮“通路”，未出现丁达尔现象；右侧壳聚糖－盐酸小檗碱纳米粒溶液具有丁达尔现象。

图4 小檗碱水溶液及小檗碱纳米粒水溶液的光学现象观察

3.5 小檗碱纳米粒的体外释放

通过不同时间点的吸光值计算累积释放量，并绘制时间－累积释放量图。从图5 可知，壳聚糖－小檗碱纳米粒在最初的几个小时内有一个快速释放的现象，其中0.5 h内累积释放量为（28.86±3.28）%，这可能是由于吸附纳米粒表面的药物释放所引起的，6 h内累积释放量为（70.52±2.91）%，这一现象有利于药物能够快速起效。其中8～24 h均速释放，24 h内累积释放量为（77.92±2.18）%。

图5 小檗碱纳米粒在PBS溶液37 ℃下的体外累积释放量

3.6 小檗碱纳米粒稳定性的考察

从图6 可知，30 d 内小檗碱纳米粒粒径波动幅度较小，其平均粒径大小均在200 nm 左右，说明小檗碱纳米粒分散均匀，没有聚集现象出现。

图6 小檗碱纳米粒水溶液在4 ℃下30 d内的稳定性

4 讨论

小檗碱是中药黄连的主要活性成分，有着广泛的药理作用，如抗炎、抗菌、降压、降血糖等［10］。随着对其药理作用的研究的深入，其在制剂方面的发展也越来越快［3］。小檗碱为黄色针状结晶，颜色随着温度的变化而变化，具有强碱性，溶于热水，难溶于乙醇等物理特性［11］。由于水溶性较差，口服利用度较低而限制其应用。因此本课题主要通过制备小檗碱纳米制剂来增加它的应用范围。离子交联法是纳米粒制备中的一种常用方法［12］，壳聚糖分子中的大量活性氨基在酸性介质中可以质子化形成多聚阳离子电解质，因此可以利用壳聚糖分子的正电荷和其他负电性的分子的静电作用来制备纳米粒［13］。目前离子交联法常用的负电性分子主要有聚谷氨酸、十二烷基硫酸钠及三聚磷酸盐（TPP）等。

本研究利用小檗碱带有负电荷、壳聚糖带有正电荷，在交联剂（三聚磷酸钠）的作用下，采用离子交联法制备，将其制备成小檗碱纳米粒。研究表明，粒径大小与药物和载体的比例有关［14］，因此，有必要考察药物与载体比例对纳米粒粒径的影响。当药物与载体的比例为1∶1 时，由于比例过小可能会导致药物未能完全包裹在载体内，会有大量药物呈现游离状态存在，未形成小檗碱纳米粒，导致粒径过大，其平均粒径为（618.6 ±10.5）nm，PDI平均为0.91±0.13；当药物与载体的比例为1∶6 时，其平均粒径为（450.4±6.9）nm，PDI 平均为0.48±0.11，由于比例过大可能会由于载体自身聚集形成壳聚糖纳米粒，从而影响小檗碱与载体的结合率且造成经济方面的浪费，所以经过实验，选定药物与载体的比例为1∶4，其粒径、PDI 值较小，平均粒径为（178.0 ± 11.4）nm，PDI 值为0.18 ± 0.09。本研究成功制备了小檗碱纳米制剂，并针对其进行表征，最后得出小檗碱纳米制剂，改善了小檗碱药物本身存在的问题，但是本研究存在着一定的不足之处，样本量较少，同时也希望在之后的临床方面能够尽快得到应用。