血小板病原体灭活技术的临床应用现状及前景展望

张永鹏 洪缨

除了已知经血液传播的病原体如HIV、HBV、HCV、HTLV、疟原虫、梅毒螺旋体外，新的未知病原体爆发频率和多样性的增加，威胁着血液供应。目前，浓缩血小板（platelet concentrates，PCs）来自单采或全血制备，储存在20～24℃持续轻缓振摇的透气塑料袋中，因储存过程中血小板存在储存损伤和细菌污染的风险，保存期一般为5 d。为了降低细菌污染风险，采取一系列措施如：采血前严格筛查献血者、严格消毒穿刺部位皮肤、使用带旁路系统的采血袋将最先流出的血液用于检测、去除PCs中的白细胞、检测特定病原体等。对22项研究进行的meta分析发现[1]，PCs初次细菌培养的污染率为0.51/1 000。另一项研究表明，PCs输血传播感染（transfusion transmitted infections，TTIs）的发生率（1.95/100 000）高于1～6℃储存的红细胞（RBC）（0.53/100 000）[2]。虽然美国FDA强制要求在储存期间对每袋PCs进行2次细菌培养或快速检测[3]；英国国家卫生血液和移植系统及北爱尔兰输血服务机构建议在进行PCs细菌检测时，加大接种量、延长培养时间[4]，这些方法既增加了检测成本和时间，也仍不可避免输血相关败血症的发生[3]。PI技术是一种主动干预措施，通过在PCs中加入或不加入光敏剂（Amotosalen或核黄素），经紫外光（UV）照射破坏病原体核酸的一类技术，可减少新出现或已知病原体的传播风险[5]。

1 PI技术和病原体灭活能力 单采或全血制备混合PCs可实施PI技术。理想情况下，PI技术应能灭活PCs中的所有病原体，且不损害血小板功能，对患者安全。但UV照射和/或残留的光敏化合物和产物可能对患者产生不良影响。目前用于PCs的PI技术有三种：Intercept（Cerus Corporation）、Mirasol（Terumo BCT）和Theraflex UV-Platelets system（MacoPharma），前两种已在临床常规使用，第三种还处于临床试验阶段。影响PI技术的因素主要包括：某些病原体载量过大，超出处理能力；病原体抗性（如芽孢）；保存血袋几何形状干扰导致难以接近病原体；干扰物质导致光能传递不佳；制备过程中的人为差错等[6]。

Intercept是加入amotosalen，经紫外光A（ultraviolet A,UVA）（波长320～400 nm；3 J/cm2）照射3～4 min后，amotosalen可插入脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的螺旋区域，与核酸形成共价健，有效破坏核酸，未结合的光敏剂则在程序的最后一步被吸附，根据PCs容量耗时约6～24 h[7]。NUSSBAUMER等[8]将7种常见细菌以3种浓度（1～10、10～100或100～1 000 CFU/单位）接种于单采血小板中，22±2℃振摇储存过夜，用amotosalen/UVA系统处理，在有氧和厌氧条件下，分别在第1、2、5 d进行细菌培养测试，培养结果全为阴性。将高感染力的黄热病病毒（yellow fever virus，YFV）（YFV-17D疫苗株）掺入单采血小板中，通过Intercept系统可灭活PCs中高浓度YFV-17D，降低了YFV TTIs风险[9]。

Mirasol是加入核黄素（维生素B2），经紫外光A+B（ultraviolet A+B,UVA+B）（波长280～400 nm；6.2 J/mL）照射4～10 min，通过电子转移对核酸造成不可逆转的破坏，核黄素及其副产物是天然存在的，已知没有任何副作用，处理后无需去除[10]。将表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌以102～107CFU/单位接种到血小板中，经Mirasol系统处理后，用BacT/Alert微生物检测系统进行培养。当PCs中接种102～103CFU/单位细菌量时，所有细菌均可被完全灭活。当PCs中接种细菌量超过106CFU/单位时，不能被完全灭活[11]。将20种菌株接种到血小板中，结果表明核黄素和紫外线照射对灭活＜20 CFU/单位的细菌有效率为98%[12]。用8种病毒评估Mirasol效果，处理前确定初始病毒载量，处理后重新检测病毒载量，病毒量降低1.8 log～6.3 log，降低了未经筛选病毒的输血传播风险[13]。PIOTROWSKI等[14]监测6年内超91 000单位经Mirasol处理的PCs数据，未发现有输血相关败血症、病毒传播及其他严重不良反应的报告。

Theraflex UV-Platelets system使用紫外光C（ultraviolet C,UVC）（波长254 nm；0.2 J/cm2）照射＜1 min并剧烈摇动，使核酸相互作用形成嘧啶二聚体，从而阻止核酸复制，目前正处于临床试验阶段[15，16]。该方法不需要添加光化学试剂，但血浆蛋白会吸收UVC光，阻止光的穿透，因此该方法对血浆中的PCs无效，只能处理血小板添加液（platelet additive solution，PAS）中的PCs。采用该技术处理后，对PCs相关的污染细菌量对数减少值为3.1～7.5[16]。血小板中掺入严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV），克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean–Congo haemorrhagic fever virus，CCHFV）和尼帕病毒（Nipah virus，NiV），Theraflex处理后，可降低SARS-CoV（≥3.4 log），CCHFV（≥2.2 log）和NiV（≥4.3 log）的传染性[5]。将登革热（Dengue virus，DENV）、基孔肯雅热（Chikungunya Virus，CHIKV）和罗斯河（Ross River virus，RRV）3种虫媒病毒掺入PCs，采用不同剂量UV处理，观察到病毒灭活分别为4.43、6.34和5.13 log，随着UV剂量增加，病毒灭活效率随之增加，因此该系统可用于新兴虫媒病毒的灭活[17]。

对于细菌污染严重的PCs，由于存在一些有毒性的代谢物质，即使实施PI技术，仍会构成严重的输血反应。若在PCs采集制备时尽早实施PI技术，足以将相关细菌的TTI风险降低至接近零。血液中的病毒载量取决于多种因素，例如宿主的免疫状态，病毒株和感染过程。病毒感染可分为三个主要阶段：①窗口期，在此期间病毒载量较低；②病毒大量复制的加速期，机体病毒载量呈高峰；③当免疫系统限制病毒增殖时，导致病毒完全消除或呈低载量携带状态[18]。病毒载量到达峰值时患者通常出现临床症状，可通过对献血者的医学评估排除急性感染，但无症状个体中可能存在高病毒载量，很难排除具有高度传染性的献血者[5]，而若利用PI技术则可有效降低病毒传播的风险。

2 PI-PCs血小板功能和质量 通过观察血小板形态变化、低渗休克反应、不同激动剂诱导的聚集粘附、葡萄糖消耗、乳酸含量、pH和血小板膜上的活化标记物（CD62p，CD63，CD40L）表达和凋亡，来确定储存期间体外血小板功能和质量[19]。与未处理的血小板相比，储存5～7 d后PI-PCs血小板功能和质量有差异，这可能是由于单采（不同机型）和全血制备方法（富板浆法或白膜法、汇集）的差异，或使用100%血浆与血浆加血小板添加液（platelet additive solution,PAS）及献血者间的变异性和测试方案差异造成的[20]。经UVC处理的PCs储存5天后，血小板体外代谢和激活发生微小变化，回收率和存活率均有一定程度降低[21]。通过全面代谢组学研究发现，Intercept系统会显著改变存储PCs的代谢组学，但不会影响血小板的能量代谢[22]。Mirasol处理对血小板衍生微囊泡（MP）的microRNA谱图没有显著影响，而Intercept会导致血小板衍生MP的microRNA水平发生明显的变化[23]。采用质谱技术分析血小板蛋白质组学，发现Mirasol PRT影响血小板中的几种蛋白质，而这些蛋白质主要与血小板粘附、激活和脱粒有关[24]。维生素B2和UV处理单采血小板后，随着储存时间的延长，血小板源细胞因子[趋化因子C-C基序配体3（Chemokine C-C motif ligand 3，CCL3）、趋化因子C-C基序配体5（chemokine C-C motif ligand 5，CCL5）、人转化生长因子（human transforming growth factor-beta 1，TGF-β-1）、血小板因子4（platelet factor 4，PF4）]含量显著高于常规的PCs[25]。UVC处理经全血分离悬浮PAS中的PCs，导致血小板活化及活性氧簇生成增加，使其凋亡增加，对血小板体外功能有一定影响[26]。PI技术对血小板整体蛋白质组的影响相对较弱，但可导致存储损伤，Mirasol影响血小板形状和粘附力，而Intercept似乎影响细胞内血小板活化途径的蛋白质，Theraflex则影响血小板形状和聚集[27]。PI技术处理可增加血小板活化和血小板衍生的MP，损伤microRNA和线粒体DNA，影响其功能[28]。与未处理血小板相比，受损血小板可被循环中的免疫监视系统识别并清除。

3 PI-PCs临床输注 很多研究评估了PI-PCs的临床疗效。患者输注常规PCs后的CCI值显著高于经Mirasol处理的PCs，然而两组的PCs和RBC输注量并无显著差异，较低CCI是否会导致出血风险增加需要进一步研究[29]。GARBAN等[20]对amotosalen和UVA处理PCs的研究发现，在恶性血液病血小板减少症患者中，PI-PCs临床疗效等同于PAS-PCs，但CCI值比输注常规PCs的患者低。这表明观察到的某些影响可能是由于PAS本身而非PI技术所致。SCHULZ等[30]研究发现，常规PCs或PI-PCs输注后，两组患者的RBC输注量、血小板输血不良反应率和类型相似，没有观察到输注PI-PCs相关的光疗皮疹病例。关于Intercept技术，对于接受光疗治疗高胆红素血症新生儿，需要关注残留amotosalen引起皮疹的可能性[31]。最近Cochrane系统评价了12项随机对照试验，在血液病患者中，比较Intercept和Mirasol处理PCs与标准PCs输注的临床效果，数据表明，与标准PCs输注患者相比，PI-PCs组因24 h CCI低而需要输注较多的PCs，同种免疫导致PCs输注无效风险增加。中等质量的证据表明，输注PI-PCs不会影响全因死亡率以及导致严重不良事件的风险[32]。BAHAR等[33]回顾性分析了28个月中接受常规PCs和PI-PCs患者的PCs和RBC需求变化，结果表明，PIPCs组平均PCs输注间隔（20.3±13.5）h短于常规PCs组（21.2±14.2）h，PCs输注量较高（P＜0.05），但RBC输注较少（P＜0.05），其他输血反应（非败血症）率无差异（P＞0.05）。常规PCs输注后出现5例输血相关败血症（P=0.011），PI-PCs输注后无输血相关败血症，其他类型输血的风险未增加。一项观察性研究发现，新生儿输注了Mirasol处理的PCs后无不良反应，似乎是安全的，但仍需要对长期输血的儿童进行随访[34]。一项针对19 175例输血的血液预警项目显示，PI-PCs输注后报道的不良事件很少见，并未出现输血相关急性肺损伤、TA-GVHD和输血传播感染[35]。法国血液预警系统2008年～2014年数据显示，PI技术处理PAS-PCs的过敏反应率也较低[36]。

4 面临的问题 形成芽孢的细菌和无包膜病毒以及缺乏核酸的病原体（如朊病毒）不能被PI技术有效灭活[37]。对于有活动性出血或儿科患者，PI-PCs的安全性有待确定。PI-PCs是否能降低同种免疫的风险，目前尚未明确。PI技术引起的血小板损伤，是否会降低输注后体内血小板存活率？PCs中白细胞数量和种类不同（制备技术不同所致）、存储时间不同、ABO不同型输注、患者同时输注其他血液成分均可能会影响血小板功能，因此，需要对PI技术进行更多、更大型研究来证实是否对血小板功能造成影响[38]。

5 总结 欧洲使用PI-PCs已经超过15年，Intercept系统是目前美国FDA批准的PI-PCs技术。已有数据表明，PI技术对血小板功能有一定影响，疗效略低于常规血小板，但临床使用是安全的。在CHIKV和寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）爆发期间，应用Intercept系统有效控制了感染风险[39，40]。当新的和/或未知病原体通过输血传播时，实施新病原体的检测需要一段时间，可采用病原体灭活技术防止其经输血传播。我国目前血小板尚未实施PI技术，无论是引进还是自主研发，作为技术储备，都需要此项技术应对未来突发公共血液安全问题。

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