肠道病毒EV-D68 的研究进展

黄 浩

（梧州市疾病预防控制中心传染病科，广西梧州 543002）

肠道病毒D68（EV-D68）是肠道病毒属的一种。肠道病毒属包括人肠道病毒A、B、C、D 和人鼻病毒A、B、C，按不同的基因型可进一步分类。与大多数耐酸并在胃肠道繁殖的肠道病毒不同，EV-D68 对酸敏感，其物理生化特性与其他肠道病毒差异较大，反而与人类鼻病毒（Human rhinovirus）较为相似，感染后主要引起呼吸道疾病，少数病例可表现为神经系统疾病和急性弛缓性脊髓炎（Acute flaccid myelitis，AFM），严重情况下甚至可以导致感染者死亡[1]。目前，EV-D68 还没有针对性的疫苗和特效药物。本文就EV-D68 在流行特点、病毒结构、致病机理方面的研究进行综述，为更好地预防和控制EV-D68 相关疾病及疫苗的研制提供理论依据。

1 流行情况

1962 年EV-D68 病毒毒株首次在美国加州分离。20 世纪60 年代观察到的、相关记录表明：EV-D68 与散发的呼吸道疾病病例有关。美国在1970 年和2005年仅报告了26 例，1970-2013 年间在欧洲、非洲和东南亚共报告了699 例。2014 年夏末出现EV-D68 导致儿童严重呼吸道感染的疫情爆发，美国报告了1153 例严重呼吸道感染和107 例AFM。加拿大近700 例，包括8 例AFP 和其他神经系统疾病；智利有2 例；欧洲为408 例；中国、泰国报告25 例AFM 病例。2014 年后该病毒虽仍在世界范围内广泛流行，却未再出现如2014年般大规模的疫情。对疾病认知增加及诊断方法提高、部分Clade B 毒株VP1 蛋白的特异性氨基酸改变和基因重组，被认为是爆发的可能原因[2-3]。

大多数EV-D68 感染的病例报道来自儿童，而血清学调查显示感染涉及所有年龄组，血清阳性率在50～59 岁的人群最高[4]。流行季节处于或晚于典型的肠道病毒季节（夏秋）[5]。北半球检测高峰出现在8～10 月，持续到冬季。南半球的新西兰6 月（冬季）为发病高峰。南非为4～7 月（秋冬）。泰国则在夏季和雨季（5-10 月），菲律宾主要在旱季，部分病例出现在雨季[6-9]。

EV-D68 至今出现多个亚型和分支，包括原型株（Fermon 株）和4 个分支（Clade A、B、C 和D）。Clade A、B、C 在美洲、欧洲和亚洲普遍存在且引起共循环，但Clade C 是最不常见的亚型。美国2014 年疫情和近年流行株为Clade A1、B1、B4、B5。2014 年的欧洲，如意大利和荷兰，流行株为Clade A1、D、B1 和B2。加拿大是Clade B2。在泰国、日本等亚洲国家，报告为Clade B 和C。中国则为Clade A2（2016 年以来被重新分类为分支D）和B2[10-11]。中国自2006 年开始发生基因群替换，2011 年8 月以Clade A 为主，其他株仅零星分布。Clade B 于2011 年10 月出现，并与Clade A 共同流行至2013 年11 月。在2014 年，优势株由Clade A 向Clade B[12]转移。幸运的是中国的基因群替换并没有导致疫情爆发。

2 进化

EV-D68 自原型株以来经历了重大的遗传变化。主要变异区域包括VP1 衣壳蛋白、5’UTR 和一些非结构蛋白。VP1 在抗原性中起主要作用，是受体结合位点。VP1 序列的变异可能是EV-D68 发生流行病学转移的原因之一。非结构蛋白2C 和3Dpol 也是常见的变异位点，是病毒复制的关键决定因素。部分分支毒株与原型株在核糖体进入位点（IRES）和开放阅读框（ORF）之间的5’UTR 出现空间压缩的差异，可能与内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）活性增加有关[13-14]。包括脊髓灰质炎病毒在内的其他肠道病毒中，5’UTR 是被公认的毒性决定因素，其变异可能有助于增强毒性[15]。荷兰发现2010 年EVD68 循环增加与VP1 基因序列多态性增加相一致[16]。2012-2014 年美国在AFM 病例分离的Clade B1 株在整个ORF 中包含6 个多态性，其中5 个与脊髓灰质炎病毒和EV-D70 序列同义[17]。另外2014 年美国与AFM 有关的Clade B1 株发现与其他嗜神经肠道病毒共有的12 个多态性主要集中在5’UTR，其次是2C、VP1 和3D[18]。Clade B3 与B1 具有共同祖先。Clade B3 的多态性分布在整个ORF 中，以VP1 最常见。但与嗜神经的Clade B1 序列相似的多个位点并不存在。而美国和欧洲2016 年和2018 年的疫情中以Clade B3 为主导，包括AFM 病例[19-20]，2018 年美国分离株都是Clade B3[21]。这些单核苷酸突变通常被认为是病毒复制过程中的随机事件。此外还观察到如5’UTR间隔区缺失，至少有一次亚支之间的重组等更大的突变事件发生，因此病毒进化与AFM 发生之间的关联仍有待进一步研究。

3 血清流行病学

2015年中国（不包含港澳台地区）的一项调查发现，产前妇女及新生儿EV-D68 中和抗体阳性率为100%，6个月至1 岁的婴儿中和抗体滴度均低于1∶64。分析认为产前妇女可将EV-D68 抗体传递给新生儿。2017年中国台湾省的调查发现，1 岁以下婴儿的EV-D68 血清阳性率为32%，1 岁儿童为18%，2 岁～15 岁阳性率由43%升至98%，16～49 岁的成人为100%[22]。数据结果显示：1 岁以下婴儿血清中和抗体滴度与年龄呈负相关，1～15 岁儿童则与年龄呈正相关，11～15 岁儿童滴度最高。此外，婴儿0～8 月的血清阳性率和抗体滴度逐渐下降。8 月后抗体滴度缓慢增加，中和抗体阳性率则进一步下降，提示婴儿在8 个月左右可因来自母体的抗体的保护力下降而出现早期感染。中国内地、芬兰、英国、荷兰、美国等地的研究有相似的结果，血清阳性率在不同国家之间没有很大差异[5，23]。日本发现血清中和抗体滴度在疫情期间上升，但疫情后的一年内下降[24]。因此，可能EV-D68 已在世界范围内广泛传播，但仅报道了有限数量的严重病例。

4 病毒结构

EV-D68 的衣壳由VP1、VP2、VP3 和VP4 四种不同病毒蛋白各60 个拷贝组成。VP1-VP4 构成一个不对称的亚单位，5 个亚单位形成五聚体，12 个五聚体组成病毒衣壳。VP1、VP2 和VP3 以伪T=3 的对称规则构成衣壳外表面，各自由两个反向平行的蛋白片段构成一个内部疏水的β 桶状结构的“果冻卷”样褶皱，其二级结构是8 条反向平行的β 链[25]。VP4 在衣壳内表面形成一个延伸的肽段，与病毒内部的RNA 基因组相接。5 个五聚体顶点形成一个表面凹陷的结构（“峡谷”），是与唾液酸等受体结合的位置[26]。峡谷北侧（North rim 区）由VP1 的BC、EF 和HI 茎环形成。峡谷南侧由puff区（VP1 的GH、VP2 的EF 茎环和部分VP1的C 端的残基）、knob 区（VP3 的N 端和VP1 的C 端的部分氨基酸残基组成）和VP2 的HI 和VP3 的HI茎环共同构成。与其他EV 比较，EV-D68 的VP3 C 端α 螺旋结构较短，因此，峡谷较其他EV 狭窄，无法与大分子蛋白结合。Liu[27]等发现酸性条件下，完整病毒颗粒出现VP1-VP4 旋转，直径约扩展8Å 膨胀形成E1 颗粒，靠近五倍轴的VP1β-桶状体和茎环以铰链方式重排，VP2 的N 端氨基酸残基重排，二倍轴周围产生了6×15Å 大小的孔洞，五聚体相互连接减弱，从而导致VP4的内化和VP1 N端外化，E1颗粒转变为A颗粒（即脱壳中间体），位于峡谷底部“口袋因子”挤出导致病毒颗粒去稳定化，释放感染性遗传物质后转变为空颗粒。

VP1 的BC 和DE 茎环在小核糖核酸病毒中是结构上最多变的。EV-D68 VP1 有两个无序区域，分别对应于BC 茎环的80-86 残基和DE 茎环的129-136 残基，这两个区域都接近五重轴。在HRV 上这些区域通常是中和性免疫原位点[28]。因此，在五重轴周围灵活的免疫原性区域可能是逃避宿主体液免疫反应的一种替代机制。

5 致病机理

与人类鼻病毒（HRV）物种成员相似，33 ℃曾被证明是EV-D68 的最佳生长温度。但2014 年分离的毒株在32 ℃和37 ℃下复制效率相同[13]。这有可能导致新的EV-D68 毒株明显增加了引发全身感染和神经侵袭的倾向。

ICAM-5 对唾液酸依赖/非依赖的EV-D68 毒株都能增强病毒复制。在不敏感的细胞株中传染该蛋白会导致EV-D68 感染[29]。α2，6 和α2，3 唾液酸受体均是EV-D68 的功能受体。由于唾液酸受体的表达在上呼吸道（α2，6 唾液酸受体为主）和下呼吸道（α2，3 唾液酸受体为主）之间存在差异。EV-D68 对α2，6 唾液酸受体的亲和力强于α2，3 唾液酸受体[30]。因此引起的疾病仍然以上呼吸道感染为主。

部分毒株可能保留与唾液酸结合的能力，同时存在其他的黏附因子或受体结合机制[29-30]。2014 年美国疫情期间发现的3 个Clade B 毒株能够不依赖唾液酸感染人，诱导多能干细胞衍生的运动神经元。此外EVD68 还可以用硫酸糖胺聚糖代替唾液酸。唾液酸、硫酸糖胺聚糖和ICAM-5 可能不同程度地增强EV-D68 毒株的感染，但不是感染所必需的。尤其是ICAM-5，因为人体呼吸道和脊髓并不表达ICAM-5。

AFM 是最受关注的EV-D68 引起的严重疾病之一。毒株的进化可能影响EV-D68 的神经嗜性：当代毒株（包括Clade B 的三个亚支）比原始株（Fermon 株、Rhyne 株）或2012 年的Clade A 毒株更易侵染神经元样SH-SY5Y 细胞[12]，并且对运动神经元有更强的趋向性[31]。Messacar 等人[32]发现EV-D68 可通过鼻腔上皮嗅神经末梢的功能受体浸染中枢神经系统，可能与神经系统疾病有潜在关联。病毒通过周围神经传播到中枢神经系统是神经侵袭性肠道病毒疾病的一个重要而保守的机制。Hixon[31]等发现EV-D68 麻痹性毒株IL/14-18952 可通过远端轴突被运动神经元吸收，然后沿轴突微管逆行到达神经元胞体，但不能通过轴突的顺行运输从轴突释放。提示逆轴突转运是EV-D68 中枢神经系统感染的主要机制，其他还可能间接通过顺行感觉和小脑连接或病毒血症后肌肉感染逆行进入脊髓。在进入神经肌肉系统之前可能会经历鼻内、肺、血源性感染，类似于脊髓灰质炎病毒从口咽部经胃肠道进入全身感染[13]。

6 展望

长久以来，EV-D68 作为引起严重呼吸道感染疾病和AFM 的病原体为人所关注。目前EV-D68 在世界各地均有流行，人群的血清阳性率提示其感染率较高。但全球未建立起相应的监测系统，因而无法对其造成的卫生负担进行准确评估。在没有特效药物和疫苗可以使用的当前，如果肠道病毒D68 变得更加流行，易感人群中、特别是有潜在呼吸道疾病的儿童，将面临严重呼吸道疾病和破坏性神经系统疾病的风险。有学者建议将EV-D68 的病原监测纳入到已经建立且运作良好的脊髓灰质炎病毒监测系统[28]，或是将其纳入非细菌性呼吸道疾病患者的一般病毒检测项目中，并建立起相应的监测网络，以进一步了解其发病突然上升的机制及其异常、严重、复杂的疾病表现。对于EV-D68 感染的相关受体及引起神经系统疾病、AFM 等严重症状的机理，都有待通过进一步的研究和建立完善监测网络来给出答案。