黄芩素衍生物对大鼠急性肝性脑病模型的干预*

范栢爽 ，吴梓君 ，刘世豪 ，李思勤 ，王丽莉 ，何新 ，

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.中国医学科学院/北京协和医学院药物研究所，天然药物活性物质与功能国家重点实验室，北京 100050；3.广东药科大学，广州 510006）

肝性脑病又称肝昏迷，是由肝功能严重障碍和/或门静脉—体循环分流异常引起的脑功能障碍，表现为一系列从亚临床改变到昏迷程度不等的神经精神异常综合征，包括认知功能、情绪、行为和运动功能的异常改变[1-2]。临床上主要分为A、B、C 3型，其中A型是由于急性肝衰竭导致的肝性脑病，其特点为起病急、病程长、病死率高达80%[3]。目前肝性脑病的治疗主要为去除诱因、脱氨、人工肝及肝移植，已取得较好的治疗效果[4]，但各有其局限性，因此探索新的预防及治疗方法有重要的现实意义。

黄芩素，是从中药黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根分离出来的黄酮类单体化合物，是黄芩中最主要的活性成分之一，也是主要的药效物质基础[5-6]。现代研究表明黄芩素具有许多药理活性，如抗病毒、抗菌、清除自由基、抗过敏、治疗癌症等[7]。此外，黄芩素还具有较好的保肝和神经保护作用，有研究显示黄芩素对四氯化碳（CCl4）、药物等诱导的许多急慢性肝炎、肝纤维化和肝癌有良好的防治作用，对神经毒性有较强的神经保护作用[8-9]。但由于其生物利用度低、水溶性差，限制了其临床应用[10]。有报道，对黄芩素进行磺酸化改造后，应用到CCl4诱导的小鼠急性肝损伤实验中，结果与黄芩素相比，磺酸化黄芩素有更好的保肝效果，且增加其体内吸收量[11]。A型肝性脑病模型有多种，在药物诱导方法中，硫代乙酰胺（TAA）诱导的动物模型，具有可重复性、易观察分期、成功率高、与人类肝性脑病相似度高等优点[12]。故本研究采用TAA法诱导大鼠急性肝性脑病模型，探讨黄芩素衍生物二磺酸基黄芩素（DB）对急性肝性脑病大鼠的干预作用及其可能的作用机制，以期为肝性脑病的治疗提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SPF级Wistar雄性大鼠，72只，体质量220～240 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号[SCXK（京）2016-0006]，动物批号1100112011037688，于中国医学科学院放射医学研究所饲养，动物实验室许可证号SYXK（津）2018-0008。饲养条件：温度20～25℃，湿度40%～60%，每日光照12 h，自由摄食饮水，均用标准饲料。所有大鼠适应性饲养1周后进行实验。所有实验符合天津中医药大学动物实验伦理学规定。

1.2 实验药物与试剂 DB（实验室自制，经核磁测定纯度高于98%[13]）；硫代乙酰胺（上海生工生物工程股份有限公司，批号F514BA0026）；乳果糖口服溶液（北京韩美药品有限公司，批号20050006）；γ-氨基丁酸（GABA）试剂盒（美国MyBiosource公司，批号 36361656）；谷氨酸（Glu）试剂盒（美国MyBiosource公司，批号20200929C）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（美国 R&D Systems公司，批号 P219559）；白介素-6（IL-6）试剂盒（武汉华美生物工程有限公司，批号X23014810）；BCA试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20200817）；β-肌动蛋白/β-Actin（内参）抗体，羊抗兔IgG二抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为AG07197903、BJ05217694）；磷脂酰肌醇 3激酶（PI3K）抗体（万类生物科技有限公司，批号I05182196）；磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号23）。

1.3 主要仪器 DB001 Morris水迷宫视频分析系统，北京智鼠多宝生物科技有限责任公司；NX10N快速血氨测定仪，日本Fujifilm公司；7020型全自动生化分析仪，日本Hitach公司；Microfuge-22R型高速离心机，美国Beckman公司；AX205型十万分之一天平，瑞士Mettler Toledo公司；GL-88B涡旋混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；PowerPac型电泳仪，美国Bio-Rad公司；VILBER Fusion FX5凝胶成像仪，北京五洲东方科技发展有限公司；FE28型FiveEasy Plus台式pH计，上海屹利科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 大鼠适应性饲养1周后，随机分为6组，每组12只，分别为对照组，模型组，DB 低、中、高剂量（6.25、25、100 mg/kg，给药剂量为前期的预实验结果）组和阳性药（乳果糖，6 g/kg）组。DB组和阳性药组每天灌胃给药1次，连续给药7 d，对照组和模型组均灌胃等体积生理盐水。于给药第6天开始造模，除对照组外，各组大鼠均腹腔注射硫代乙酰胺（TAA，300 mg/kg[14]）1 次，连续 2 d，对照组腹腔注射等体积生理盐水。造模期间，为防止大鼠发生电解质紊乱等并发症，从首次腹腔注射TAA后，每12 h皮下注射3 mL 10%葡萄糖、2 mL生理盐水和20 μmol氯化钾的等量混合液。末次腹腔注射TAA后将全部大鼠禁食12 h，次日以10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，于冰上迅速取肝、脑组织。

2.2 指标检测

2.2.1 大鼠一般状态、分期评分及死亡率 观察各组大鼠在造模前后精神状态、毛色、活动、死亡情况并记录。根据大鼠肝性脑病诊断标准[15]，若大鼠出现嗜睡、反应迟缓，自主活动减少、共济失调、昏迷等症状之一，则可诊断为肝性脑病，并根据Zimmermann法[15]对大鼠肝性脑病分级进行评分，见表1。

表1 肝性脑病的分级评分标准Tab.1 Grading and scoring standards for hepatic encephalopathy

2.2.2 行为学检测 将水注入直径130cm、高50cm的圆形黑色内壁水池中，水深25 cm、水温（25±1）℃，水下1.5 cm处放置黑色平台（8 cm×8 cm），池壁上贴有不同颜色的 4 个数字：1、2、3、4，它们将水池平分为4个象限。测试前1 d将所有大鼠放入水池中自由游泳90 s。随后将所有大鼠每天训练4次，每次90 s，共训练5 d，将大鼠头朝向池壁依次从4个象限入水，当90 s已到或大鼠已找到平台，停止录像，并让大鼠在平台上休息20 s，记录大鼠寻找并爬上平台的时间（寻台潜伏期），未找到平台的大鼠记为90 s。于第6天，记录大鼠寻台潜伏期和撤掉平台后90 s内穿越原平台位置的次数（即穿环指数）。

2.2.3 血氨和结肠内容物pH测定 末次腹腔注射TAA 24 h后进行取眼眶血，应用快速血氨测定仪检测大鼠全血中氨的含量。取大鼠回盲肠后端结肠大约10 cm，采用pH计法检测结肠内容物pH值。

2.2.4 血清及肝生化指标测定 采用全自动生化仪检测血清中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBiL）的浓度。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清中TNF-α和IL-6水平。

2.2.5 肝组织病理检查 剪取肝组织左叶，置于4%多聚甲醛中固定，脱水、包埋和切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，在光学显微镜下（×100）观察肝脏病理变化。

2.2.6 神经递质含量检测 称取大鼠前额叶皮质组织，制成10%的匀浆，按照试剂盒说明书测定前额叶皮质中GABA和谷氨酸含量。

2.2.7 蛋白免疫印迹法检测大鼠前额叶皮质中PI3K，p-AKT蛋白的表达 取各组大鼠前额叶皮质组织，加入细胞裂解液，裂解后离心取上清液，采用BCA定量试剂盒法进行蛋白测定。然后进行SDS凝胶电泳，转膜、封闭、一抗孵育4℃过夜，二抗室温孵育1 h后使用化学发光剂曝光，应用Image-Pro Plus 6.0软件进行结果计算。

2.3 统计学方法 应用GraphPad Prism 5.01统计软件进行统计学分析，结果用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，采用Tukey法进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 对大鼠一般状态、分期评分及死亡率的影响对照组大鼠活动无异常，神经反射灵敏。模型组大鼠首次腹腔注射TAA 24 h后，出现食欲下降，行动减缓，皮毛疏松；第2次腹腔注射TAA 24 h后，大鼠体毛明显变黄，呼吸频率加快，步态不稳，共济失调，甚至昏迷。各给药组大鼠活动减少、行动迟缓、昏迷等情况较模型组有改善。与模型组相比，DB低、中、高剂量组均可显著改善肝性脑病大鼠分级评分（P＜0.01），且可显著降低死亡率。见表 2。

表2 大鼠肝性脑病评分和死亡率比较Tab.2 Comparison of hepatic encephalopathy score and mortality of rats

3.2 对大鼠寻台潜伏期与穿环指数的影响 比较各组大鼠在造模0 h寻台潜伏期，差异无统计学意义（P＞0.05），说明组间具有可比性。末次腹腔注射TAA 24 h后，发现与模型组相比，DB低、中、高剂量组均能明显降低大鼠寻台潜伏期（P＜0.05）；DB中、高剂量组能明显增加穿环指数（P＜0.01 或 P＜0.05）。可以推测DB可改善肝性脑病大鼠的学习和记忆能力，见表3。

表3 不同时间段各组大鼠寻台潜伏期和穿环指数比较（±s）Tab.3 Comparison of seeking latency and piercing index of rats in different periods（±s）

表3 不同时间段各组大鼠寻台潜伏期和穿环指数比较（±s）Tab.3 Comparison of seeking latency and piercing index of rats in different periods（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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3.3 对血氨和结肠内容物pH的影响 与对照组相比，模型组大鼠血氨和结肠内容物pH水平均显著升高（P＜0.01），说明 TAA 成功诱导大鼠急性肝性脑病。与模型组相比，DB中、高剂量组和阳性药组均能明显降低大鼠血氨水平（P＜0.01 或 P＜0.05）；低、中、高剂量组和阳性药组均能明显降低大鼠结肠内容物pH值（P＜0.01）。结果表明DB能降低大鼠体内氨的含量，具有改善肝性脑病作用。见表4。

表4 各组大鼠血氨和结肠内容物pH值的比较（±s）Tab.4 Comparison of blood ammonia and pH of colon contents of rats in each group（±s）

表4 各组大鼠血氨和结肠内容物pH值的比较（±s）Tab.4 Comparison of blood ammonia and pH of colon contents of rats in each group（±s）

注：与对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与 DB 低剂量组比较，△P＜0.05。

结肠内容物pH对照组 - 102.0±25.40 6.76±0.19模型组 - 228.7±68.33** 7.40±0.31**阳性药组 6×103 179.0±23.43# 6.75±0.24##DB 低剂量组 6.25 194.2±49.64 6.99±0.13##DB 中剂量组 25 145.5±25.56##△ 6.73±0.19##DB 高剂量组 100 156.5±25.73## 6.57±0.24##△组别 剂量（mg/kg）血氨值（μmol/L）

3.4 各组血清及肝生化指标测定结果 与对照组相比，模型组大鼠血清中 ALT、AST、TBiL、ALP 水平均显著升高（P＜0.01），说明 TAA 诱导的急性肝性脑病模型大鼠出现严重肝脏损伤。与模型组相比，阳性药组可显著降低 ALT、AST、TBiL 水平（P＜0.05 或P＜0.01）。DB 中、高剂量组显著降低 ALT、AST、TBiL、ALP 水平（P＜0.05 或 P＜0.01）；低剂量组可显著降低 ALT、TBiL 水平（P＜0.01）。表明 DB 有较好的保护肝细胞、改善肝功能作用。与对照组相比，模型组大鼠血清中TNF-α和IL-6水平显著提高（P＜0.01 或 P＜0.05）。与模型组相比，DB 中、高剂量组能显著降低 TNF-α 水平（P＜0.01）；DB 低、中、高剂量组均能显著降低 IL-6 水平（P＜0.05 或 P＜0.01）。结果说明DB可通过抑制促炎细胞因子的表达来发挥对肝性脑病的干预作用。见表5。

表5 各组大鼠血清中 ALT、AST、TBiL、ALP、TNF-α、IL-6浓度（±s）Tab.5 Concentrations of AST，ALT，TBiL，ALP，TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s）

表5 各组大鼠血清中 ALT、AST、TBiL、ALP、TNF-α、IL-6浓度（±s）Tab.5 Concentrations of AST，ALT，TBiL，ALP，TNF-α and IL-6 in serum of rats in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别对照组模型组阳性药组DB低剂量组DB中剂量组DB高剂量组剂量（mg/kg） ALT（U/L） AST（U/L） TBiL（μmol/L） ALP（U/L） TNF-α（pg/mL） IL-6（pg/mL）-26.33± 5.96 66.80± 31.24 0.17±0.03 132.00± 37.67 28.78±1.47 48.94±20.41- 1 065.00±142.20**1 161.00±353.30** 2.39±0.55** 488.00±136.10** 37.81±3.21** 85.66±21.84*6×103 814.30±163.80# 788.80±169.60## 1.17±0.43## 472.60± 54.92 36.76±3.07 51.47±26.51##6.25 685.10±210.60## 918.00± 65.02 1.43±0.60## 410.80± 81.69 34.54±6.28 56.30±23.61#25 658.60±196.20## 655.40±133.90## 1.37±0.15## 360.30± 59.02# 28.85±4.39## 49.63±12.08##100 740.00±193.00## 839.00±198.20# 1.47±0.33## 343.40± 51.92## 29.52±5.90## 52.06± 9.51#

3.5 大鼠肝组织病理变化 光学显微镜下观察各组大鼠肝织病理切片，结果见图1。对照组大鼠肝小叶结构完整，未见肝细胞变性坏死，肝细胞排列整齐，肝索以中央静脉为中心呈放射状排列。模型组大鼠肝细胞水样变性明显，可见明显的肝细胞溶解、坏死，以小叶中心性坏死为主，桥接坏死多见，坏死区可见中重度炎细胞浸润（混合细胞浸润，以淋巴细胞为主），坏死及坏死后纤维组织增生明显，发生纤维化，小叶结构失常。与模型组相比，阳性药组肝细胞坏死及炎细胞浸润稍减轻。DB低、高剂量组水样变性减轻，炎细胞浸润减轻，坏死后肝纤维化为主；DB中剂量组炎细胞浸润，坏死，肝纤维化较模型组减轻，坏死后纤维组织增生较明显，小叶结构尚正常。

图1 DB对肝性脑病大鼠肝组织病理变化的影响（HE，×100）Fig.1 Effect of DB on pathological changes of liver tissue in hepatic encephalopathy rats(HE，×100)

3.6 对大鼠前额叶皮质中GABA和Glu浓度的影响 ELISA检测结果见表6。与对照组相比，模型组大鼠前额叶皮质中GABA水平显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，DB低、中、高剂量组和阳性药组均能显著降低 GABA 水平（P＜0.05 或 P＜0.01）。与对照组相比，模型组大鼠前额叶皮质中Glu水平出现下降趋势，各给药组大鼠Glu水平较模型组有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。结果表明，DB 可以通过调节大鼠前额叶皮质中GABA及Glu的含量来发挥对肝性脑病的干预作用。

表6 各组大鼠前额叶皮质中GABA、Glu浓度（±s）Tab.6 Concentrations of GABA and Glu in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

表6 各组大鼠前额叶皮质中GABA、Glu浓度（±s）Tab.6 Concentrations of GABA and Glu in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

注：与对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

Glu（ng/mL）对照组 - 267.90± 53.17 42.47±24.43模型组 - 652.90±205.60** 31.43± 8.04阳性药组 6×103 403.60± 94.47## 35.17±17.32 DB 低剂量组 6.25 470.50±117.40# 38.64± 5.74 DB中剂量组 25 362.30±45.90## 41.46±7.04 DB高剂量组 100 454.40±97.50## 40.77±6.79组别 剂量（mg/kg）GABA（pg/mL）

3.7 对大鼠前额叶皮质中PI3K、p-AKT蛋白表达的影响 为进一步探讨DB的作用机制，利用Western blot技术对与肝性脑病相关的关键蛋白进行分析。与对照组相比，模型组大鼠前额叶皮质中PI3K 和 p-AKT 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，DB低、中剂量组可显著降低PI3K蛋白水平（P＜0.01 或 P＜0.05）；DB 中、高剂量组可显著降低p-AKT 蛋白水平（P＜0.05或 P＜0.01）。说明 DB 可以通过调控前额叶皮质中PI3K和p-AKT的蛋白表达来发挥对肝性脑病的干预作用。见图2、表7。

表7 各组大鼠前额叶皮质中PI3K、p-AKT蛋白表达情况（±s）Tab.7 The expression of PI3K and p-AKT proteins in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

表7 各组大鼠前额叶皮质中PI3K、p-AKT蛋白表达情况（±s）Tab.7 The expression of PI3K and p-AKT proteins in the prefrontal cortex of rats in each group（±s）

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

组别 剂量（mg/kg） PI3K/β-actin P-AKT/β-actin对照组 — 0.337±0.027 0.155±0.098模型组 — 0.890±0.135* 0.609±0.173*阳性药组 6×103 0.144±0.098## 0.336±0.177 DB 低剂量组 6.25 0.233±0.254# 0.219±0.049 DB 中剂量组 25 0.181±0.099## 0.097±0.049##DB 高剂量组 100 0.442±0.373 0.143±0.140#

图2 大鼠前额叶皮质中PI3K、p-AKT蛋白表达情况Fig.2 Expression of PI3K and p-AKT in the prefrontal cortex of rats

4 讨论

本实验采用TAA诱导法建立急性肝性脑病大鼠模型，其机制为TAA被肝细胞内细胞色素P450氧化酶代谢，产生有毒的TAA-硫氧化合物，进而引起脂质过氧化、肝脏代谢紊乱等损伤，导致炎细胞浸润、肝细胞坏死及肝纤维化等改变，最终引起急性肝功能衰竭诱发A型肝性脑病[16]。该模型的3个判断标准为大鼠行为学，血氨值和肝功能指标的变化[17]。本实验发现TAA造模后，模型组大鼠行为学、血氨、肝生化指标与对照组相比，均有显著性改变，说明急性肝性脑病大鼠模型造模成功。

临床上评价药物治疗肝性脑病的效果时，主要观察指标为患者的认知功能、血氨水平和肝功能指标。本实验选择Morris水迷宫实验，它是研究动物空间学习和记忆能力常用的模型工具[18]，通过测定寻台潜伏期来评价大鼠的空间学习能力、测定穿环指数来评价大鼠的空间记忆能力。结果显示，TAA造模后，与空白组相比，模型组大鼠寻台潜伏期出现显著延长，穿环指数显著减少；预防性给予DB治疗后，中、高剂量组可显著降低寻台潜伏期，增加穿环指数，说明DB可以改善肝性脑病大鼠的学习和记忆能力。此实验选择血氨和结肠内容物pH值这两个指标来反映肝性脑病大鼠体内氨水平。结果显示，DB中、高剂量组可显著降低肝性脑病大鼠血氨水平，且低、中、高剂量组均可降低结肠内容pH值，推测其发挥作用的方式可能为DB酸化肠道后，导致肠道内细菌产氨减少，同时减少氨分子的吸收，促进血氨渗入肠道排出[19]。故DB可有效降低肝性脑病大鼠体内氨含量。本研究选择ALT、AST、ALP、TBiL作为肝功能检测指标，其中ALT和AST是血清肝生物标志物，是早期急性肝损伤的主要生化指标[20]，ALP和TBiL在肝损伤或胆汁淤积时会出现升高[21]。实验结果显示，与对照组相比，模型组上述肝功指标出现显著升高，说明模型组大鼠肝损伤严重，DB中、高剂量组可显著降低上述4个指标，说明其有较好的保护肝细胞、改善肝功能作用。此外，由于急性肝性脑病有死亡率高的特点[3]，故本研究考察了各组大鼠死亡情况，发现DB可以显著降低急性肝性脑病大鼠的死亡率，其原因与改善上述提及的指标有关。

炎症反应在肝性脑病的病理过程中发挥着重要作用，当肝脏损伤后，体内出现严重的炎症反应，大量的炎症介质与高血氨协同对大脑产生影响，其中TNF-α和IL-6能增加脑血管内皮细胞的通透性、破坏血脑屏障功能，从而引发中枢神经系统内的炎症反应。此实验结果显示，与模型组相比，DB中、高剂量组可显著降低血清中TNF-α和IL-6水平，说明DB可通过减少促炎细胞因子的表达来发挥对肝性脑病的干预作用。

神经递质异常在肝性脑病发病机制中的作用愈受关注，Jones[22]指出肝性脑病的发生是因为抑制性神经递质如GABA和兴奋性神经递质如谷氨酸功能失衡[23]。肝性脑病发生时，GABA入脑增多，影响肝性脑病大鼠学习、记忆[24]。Glu，作为兴奋性神经递质，对突触可塑性的维持、神经发育、神经元回路的形成和学习过程起重要作用[25]。本实验结果显示，DB能显著降低肝性脑病大鼠前额叶皮质中GABA含量，增加前额叶皮质中谷氨酸水平，表明DB可以通过调节大鼠前额叶皮质中GABA和谷氨酸含量，起到改善肝性脑病的作用。

为进一步研究DB对急性肝性脑病大鼠的干预作用机制，结合文献研究表明，黄芩素可通过调节PI3K/AKT通路来发挥神经保护作用[26-27]。本实验结果显示，模型组大鼠前额叶皮质中PI3K和pAKT蛋白表达较对照组显著上升，DB中剂量组可显著降低PI3K和pAKT蛋白表达，说明DB可能通过调节PI3K/Akt通路发挥神经保护作用，起到改善肝性脑病作用。

综上所述，DB能够改善TAA诱导的急性肝性脑病大鼠的学习记忆能力和肝功能，降低体内氨水平，抑制炎症因子表达，调节前额叶皮质中神经递质（GABA和谷氨酸）水平，其作用机制可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。