COPD 患者血清Rho激酶水平测定的临床意义*

黄鹤，张念志

安徽省中医院 安徽合肥 230031

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）简称慢阻肺，是一种可以预防和治疗的慢性气道炎症性疾病，气流受限不完全可逆为其主要特征。慢阻肺临床症状呈进行性加重，以胸闷、气喘，呼吸困难为主要表现。相关资料结果显示COPD发病率有显著地区差异。我国农村地区人群中COPD的男性患病率明显高于女性，部分欠发达地区患病率高达9.88%，给社会和家庭带来了巨大的经济和社会负担[1]。

慢阻肺的炎症反应主要累及肺部及气道。反复肺部感染，气道炎细胞浸润，导致黏液高分泌，形成气道的反复损伤和修复，最终导致气道重塑[2]。气道阻塞和结构重塑会导致通气功能障碍，造成机体慢性缺氧，引起相应的病理生理学改变。肺血管在长期缺氧或伴有CO2潴留条件下收缩明显增强，血管内皮细胞的增殖凋亡均发生障碍，最终导致COPD相关性肺动脉高压的产生。

ROCK1是广泛存在于人体组织中RhoA/Rho 激酶信号通路上的一个重要信号分子。近年来相关学者已经认识到慢阻肺相关性肺动脉高压与RhoA/Rho激酶信号通路密切相关[3-4]。因此本实验测定不同人群外周血清ROCK1水平及其肺动脉收缩压，并探究两者之间的相关性。

资料与方法

1 入组标准

1.1 诊断标准

1.1.1 COPD诊断标准 参照《2019慢性阻塞性肺疾病全球倡议》，具有相应症状、体征及影像学特征的对象均在我院肺功能室行肺功能测定，检查前一天均未使用任何支气管扩张剂及糖皮质激素。吸入支气管扩张剂沙丁胺醇后，肺功能测定显示 FEV1/FVC<70%才可诊断。

1.1.2 肺动脉高压诊断标准 参照2018年中国肺高血压（Pulmonary hypertension PH）诊断和治疗指南，静息状态下右心导管所测肺动脉平均压（mPAP）≥25mm Hg即可作出诊断。目前认为mPAP=0.61×肺动脉收缩压（PASP）+2 mmHg，因此PASP≥40mm Hg 即可诊断为 PH[5]。本实验采用心脏彩超所估测肺动脉收缩压值作为诊断标准。

1.2 纳入标准 参照入组标准，入选45例分为3组，每组15例。A组为健康体检者不伴有肺动脉高压 ，B、C两组均为我科住院治疗符合COPD诊断标准的患者，且 C组患者还符合心脏彩超诊断为肺动脉高压的标准。

1.3 排除标准 ①除外近期使用过他汀类药物[6]；②除外合并其他严重疾病如肝肾功能不全、肿瘤等疾病；③除外其他类疾病所致肺动脉高压，如结缔组织疾病、先天性心脏病、心脏瓣膜病、左心疾病、胸廓畸形、肺血栓栓塞、睡眠呼吸障碍等疾病引起的肺高压。

2 一般资料

选取同一时期在安徽省中医院呼吸内科住院治疗或体检中心体检健康者共45例。参照入组标准，入选45例分为3组。A组15例为健康体检者不伴有肺动脉高压，B组15例为单纯COPD患者，C组15例为COPD并发肺动脉高压患者。

3 检测方法

3.1 主要试剂与仪器 彩色多普勒超声心动图仪；肺功能仪（德国耶格）；RT-6000酶标仪（雷杜）；JW3021HR离心机（安徽嘉文）；DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温箱（上海三发）；漩涡混合器；ROCK1 ELISA试剂盒（北京安迪华泰生物）。

3.2 肺功能检查 采用我院现有德国耶格肺功能仪测定静息状态下吸入支气管扩张剂沙丁胺醇后一秒用力呼气容积占用力肺活量的比值（FEV1/FVC%）。

3.3 PASP测定 所有45例入组者均经我院心脏超声测定其三尖瓣最大返流速度（V）。将经检测所得三尖瓣最大返流速度（V）代入简化的柏努利方程，即P=4V2，PASP=4V2＋右房压。右房压力值一般为5～10mmHg之间，最终计算得到估算的PASP值。目前临床和相关研究证据均表明，心脏彩超估测肺高压与右心导管检测方式相比，不仅无创、检测方便且检查结果准确性高[7]。

3.4 血清标本的采集 收集45例入组对象空腹静脉血，将其经过3000r/min离心20min。抽取离心后的上清液1mL用于ROCK1的测定。

3.5 血清ROCK1的测定 ①标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，先在第1、2孔中分别加标准品100μL，再向其中加稀释液50μL混匀；然后从第1、2孔中各取100μL加入第3、4孔，再在第3、4孔分别加稀释液50μL混匀；然后从3、4孔中各取100μL，其中50μL弃之，剩余50μL分别加到第5、6孔中，再在第5、6六孔中加稀释液50μL混匀；后孔依法同前，最终各孔稀释后加样量均为50μL，浓度分别为 180 pmol/L，120 pmol/L，60 pmol/L，30 pmol/L，15 pmol/L。②加样：在酶标包被板上分设待测样品孔和空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）。先将10μL待测样品加入待测样品孔中，然后加入稀释液，稀释度为5倍，再将稀释样品加于酶标板孔底部混匀。温育：用封板膜封板后置37℃温育30min。配液：将浓缩洗涤液稀释30倍后备用。洗涤：温育后每孔弃去液体，甩干，用洗涤液再反复的洗板5次，拍干。加酶：每孔加入酶标试剂50μL，空白孔除外。再次温育、洗涤。③显色和终止：充分洗涤后，每孔加入TMB混合均匀后避光显色15min，当其变成蓝色后向每孔加终止液，颜色由蓝变黄表示反应终止。

④测定和计算：加入终止液后立即以酶标仪测定各孔的吸光度（OD值），15min内完成所有孔的测定，最后将各OD值代入方程式，计算得出数值。

4 统计学方法

采用SPSS21.0统计软件进行数据分析。3组性别构成比采用卡方检验。各组实验数据均为计量资料，以均数±标准差（）对各组数据进行统计描述。各指标均进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布和方差齐性一致情况下，多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，两个随机变量的相关关系采用Pearson直线相关分析。

结 果

1 3组研究对象血清ROCK1表达水平的比较

各组研究对象之间的年龄和性别组成无统计学差异（P>0.05），COPD 组肺动脉收缩压与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。COPD 并发 PH组分别与另两组相比，肺动脉收缩压显著升高且具有统计学差异（P<0.05）。COPD 组血清ROCK1与正常对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05），COPD 并发PH 组分别与另两组相比，血清ROCK1显著升高且具有统计学差异（P<0.05）。见表1。

表1 3组研究对象一般资料及血清ROCK1表达水平比较

2 3组研究对象血清ROCK1表达与PASP的相关性分析

3组研究对象中血清ROCK1水平与肺动脉收缩压呈正相关（r=0.637，P<0.05），见图 1。

图1 血清ROCK1水平与PASP的相关性分析

讨 论

随着慢性阻塞性肺疾病的进行性进展，缺氧等因素使肺循环血管阻力不断增高，右心室负荷不断增加，进而导致肺源性心脏病。肺心病已成为COPD患者三大并发症之一，是COPD患者住院和病死的主要原因。

Rho/Rho 激酶信号通路广泛存在于人体肺组织中，参与了肺部多种疾病的发生与发展，属于多种肺部疾病如肺动脉高压、哮喘等疾病的重要研究对象。Rho蛋白又被称为Rho GTP酶，其具有GTP酶活性，有 RhoA，RhoB，RhoC 三种异构体，为信号通路上游的主要分子。Rho蛋白在上游通过与GTP或GDP之间结合的相互转换来激活或失活信号通路中的下游分子Rho 激酶，进而引起下游底物产生一系列生物学效应。Rho激酶（Rho-associated kinase）又称ROCK，属苏氨酸／丝氨酸蛋白激酶家族一员，其有ROCK1（ROKβ，p160-ROCK）和ROCK2 （ROKα）两个亚型[8]。ROCK1和ROCK2亚型在体内有不同的器官分布与表达，ROCK1主要在肺脏、肝脏及骨骼肌中分布表达，而ROCK2在脑、与肌肉中表达更高[9]。ROCK分子质量大约160 kD，其氨基酸序列由 N端的催化结构域、盘旋螺旋域，PH结构域成，其中盘旋螺旋域中含Rho结合域[10]。

目前已经知道肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）决定着肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化的水平，而肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化水平的高低又是决定肺血管收缩的关键因素，与肺动脉高压的产生密切相关[11]。Rho/Rho 激酶信号通路通过活化的Rho激酶，进而通过其钙敏感性调节这一途径调节MLC磷酸化水平。活化的Rho激酶既可直接使MLC上两个氨基酸位点发生磷酸化；同时Rho激酶与其在肌球蛋白轻链磷酸酶的靶亚基 1 （MYPT1）上的Thr850相结合，使其磷酸化，导致 MLCP失活，失活的MLCP不能使磷酸化的MLC脱磷酸化，间接提升了细胞浆内MLC磷酸化水平，增加肌动－肌球蛋白交联而促进肌丝收缩。

本研究分别选取经心脏超声测定的肺动脉收缩压和人血清Rho激酶作为观察指标，PASP值的大小可直接反映着肺血管压力的高低，后者其值高低反映Rho/Rho 激酶信号通路的激活。本实验结果表明慢阻肺并发肺高血压患者血清Rho激酶表达较单纯慢阻肺患者及正常人明显升高，且PASP值与其ROCK1水平呈正相关性。慢阻肺患者肺高血压的发生发展可能与Rho/Rho 激酶信号通路激活密切相关。但本临床实验入组总样本量偏少，且未检测Rho激酶信号通路中上下游信号分子，今后在临床上能否通过检测慢阻肺患者血清ROCK1来评估肺动脉高压的严重程度仍需大样本、多中心研究数据提供更多证据。