生防菌株HG18基因组信息分析与抗菌功能基因挖掘

姜 威, 张淑梅, 闫更轩, 田 缘, 胡基华, 潘 钰, 夏海华, 吴皓琼, 于 冲*

(1.黑龙江省科学院 微生物研究所, 黑龙江 哈尔滨 150010;2.黑龙江省科学院 高技术研究院, 黑龙江 哈尔滨 150020)

长期施用化肥农药所导致的环境污染是我国绿色农业发展面临的挑战和急需解决的重要问题，研发新型微生物农药，是实现化肥农药双减、土壤修复、生态和食品安全以及农业可持续性发展的一个重要途径[1]。目前，活体微生物农药存在见效慢、应用效果不稳定和菌株退化等瓶颈问题，微生物代谢产物-抗生素农药存在抗药性问题[2]。因此，寻找新资源和新结构微生物代谢产物是微生物农药研发新方向。芽胞杆菌能够产生小肽、蛋白、脂肽、细菌素、酚类及多烯类等多种抗菌物质[3-4]，是微生物代谢产物农药研发的重要资源菌，充分挖掘抗菌物质基因可以为植物抗病育种和菌株定向遗传改造提供基因资源。挖掘功能基因常规方法是由物质到基因，即先对功能物质进行分离纯化、鉴定，再克隆全基因进行测序。组学技术的发展为寻找活性代谢产物基因提供了新方法。吕伟强等[5]通过对银杏叶内生菌KW-1-2的全基因组序列ORFs信号肽和分泌蛋白组合法预测分析，发现271个具有典型信号肽的分泌蛋白；杨晓玫等[6]通过对B.mycoidesGnyt1进行全基因组测序，挖掘到促生功能相关的基因——铁载体分泌相关功能基因；戚家明等[7]通过对生防菌株PF-1基因组测序，发现15种具有抗菌活性次级代谢产物基因簇；廖开吉等[8]利用amtiSMASH对菌株FP1761次生代谢基因簇进行预测，发现两个与嗜铁素pyoverdine合成相关的基因簇。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)是近年来发现的一类新型生防微生物，具有防病促生作用，受到国内外研究者的广泛关注[9-10]。贝莱斯芽胞杆菌HG18是1株低温生防菌，抑菌谱广，能够分泌抗菌蛋白、脂肽、IAA等多种抗病促生物质，具有很好的开发应用潜力。本研究采用二、三代结合测序技术对其进行基因组测序，挖掘抗菌相关功能基因，解析基因系统进化性，为后续基因的克隆表达及功能验证、植物抗病育种以及提高原始菌株抗菌物质产量的定向改造提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株BacillusvelezensisHG18是一株具有防病促生功能的生防菌，保存于黑龙江省科学院微生物研究所菌保中心。

1.1.2 培养基 LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.2，蒸馏水1 000 mL。

1.1.3 主要试剂与仪器 基因组提取试剂盒(N2703，天根生化科技公司)；DNA回收纯化试剂盒(M2230，天根生化科技公司)；琼脂糖。超净工作台(ZHJH-C1115C，上海智城公司)；恒温振荡培养器(ZHWY-211B，上海智城公司)；台式离心机(3K15，上海智城公司)；恒温培养箱(BPH-9082，上海一恒公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因组测序 由深圳华大基因公司完成测序，采用基于DNBSEQ二代测序平台和Nanopore三代测序平台相结合方法，分别构建测序文库，进行denovo测序。二代测序插入库大小为270～300 bp，三代测序插入库大小为20 kb。

1.2.2 序列数据处理 分别采用SOAPnuke 1.5.6和Porechop 0.2.4软件对二代和三代测序数据进行质量控制，Kmer软件校正，校正后的序列使用Unicycler v 0.4.7软件拼装。

1.2.3 基因组信息注释 采用Glimmer 3.02软件进行组装结果的基因预测，RNAmmer 1.2、tRNAscan 1.3.1和Infernal软件进行非编码RNA分析，通过Tandem Repeats Finder 4.04软件预测串联重复序列，并根据重复单元长度及数目筛选出其中的微卫星以及小卫星序列。基于GO、KEGG、Swiss-Prot、COG、NR、CAZY等数据库进行基因功能注释。

2 结果与分析

2.1 序列信息统计

二代测序获得高质量Reads 6 952 326条，高质量Reads碱基数为1 042 Mb，占比97.08%。三代测序序列长，过滤后的Reads 数为3 640 380条，碱基数为1 600 003 363 bp，最长Reads 91 343 bp，最短Reads 2 000 bp，平均Reads长度4 395 bp。二、三代测序数据质量高，保证了后续分析的准确性。

2.2 基因组组装与基因组信息

组装测序数据，进行单碱基纠正、序列环状、质粒库比对等分析，组装成一个环状染色体和一个环状质粒。染色体碱基数4 239 316 bp，GC含量43.58%；质粒碱基数222 528 bp，GC含量37.25%。基因组大小4 461 844 bp,编码4 643个基因，含有87个串联重复序列，57个小卫星DNA，6个微卫星DNA，86个tRNA,25个sRNA,10个5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，2个CRISPR和9个Prophage，23个基因岛。编码基因总长度3 893 994 bp，占基因组87.27%，GC含量44.06%，结果见表1。

表1 基因组信息

2.3 基因注释

将基因在VFDB、ARDB、TREMBL、CAZY、IPR、SWISSPROT、COG、GO、KEGG、NR和T3SS数据库中进行比对和注释，结果见表2。VFDB数据库预测了204个致病菌毒力因子，其中22个与蛋白水解和转录调控相关；ARDB数据库预测了31个与氯霉素、万古霉素、链霉素、杆菌肽相关的抗性基因；CAZY注释显示有63个糖苷水解酶GHs，15个糖类酯解酶CEs，36个糖基转移酶GTs，7个多糖裂解酶PLs，2个辅助功能AAs，40个碳水化合物相关酶CBMs；TREMBL数据库中注释的4 401个基因中有980个功能未知；COG功能注释中有228个基因功能未知(图1A)；GO功能注释了2 588个基因，归属于细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物过程(biological process)3个部分(图1B)；KEGG分析显示，62.70%基因参与碳水化合物、氨基酸、次级代谢产物、脂、糖原、能量、萜类、聚酮类、核苷酸和外源物质降解代谢(图1C)。

表2 基因注释结果

图1 菌株HG18基因组COG(A)、GO(B)和KEGG(C)分类

2.4 抗菌功能基因挖掘

基因功能分析发现6个与几丁质降解的相关基因，其中GL000617、GL001507和GL003599编码糖苷水解酶18家族蛋白，能够水解几丁质中的β-1,4糖苷键；GL000017和GL002074编码几丁质裂解酶；GL003784编码β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，可协同几丁质内切酶或几丁二糖外切酶水解几丁质。KEGG分析没有发现这些基因参与的具体代谢途径，GO功能分析显示这些基因参与碳水化合物代谢过程，发挥几丁质结合功能。系统进化分析显示这些基因与Bacillushalotolerans和Bacillussubtilis同源性较高，GL000017与B.halotoleransF41-3和B.halotoleransXH-1的肽聚糖结合蛋白基因同源性为100%，与B.halotoleransZB201702和B.subtilisKKD1同源性为99%。GL002074与B.halotoleransF41-3和B.halotoleransZB201702的几丁质结合蛋白基因同源性为100%，与B.halotoleransXH-1几丁质结合蛋白基因及B.subtilisKKD1裂解多糖单加氧酶基因同源性为99%。GL000617、GL001507和GL003599与上述4株菌的糖苷水解酶18家族基因同源性高，为99%～100%；GL003784与上述4株菌的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因同源性较高，为99%。2个葡聚糖酶基因(GL001922和GL001988)和1个壳聚糖酶GL001299也与上述4株菌株的同源性较高。另外，发现1个编码抗菌物质subtilisin的基因GL001102，系统进化分析其与B.subtilisKKD1和B.halotoleransF41-3同源性较高，为99%；1个编码抗菌物质bacillolysin基因GL001608，系统进化分析与B.halotoleransZB201702和B.halotoleransP1同源性较高，为99%。还发现脂肽类抗菌物质芬芥素与表面活性素合成基因簇，芬芥素合成基因簇含有5个基因(FenB、FenA、FenE、FenD、FenC)，全长37 518 bp，表面活性素合成基因簇含有4个基因(srfAA、srfAB、srfAC、srfATE)，全长26 076 bp。结果见表3、图2。

表3 抗菌功能基因注释

图2 部分抗菌功能基因系统进化树

3 讨 论

贝莱斯芽胞杆菌HG18是一株能产生多种抗菌促生物质的生防菌株，本研究对该菌株进行全基因组测序，从分子水平挖掘抗菌功能基因，为后续基因的克隆表达及功能验证、植物抗病育种以及提高菌株抗菌物质产量的定向改造提供参考。

几丁质、葡聚糖、壳聚糖是植物病原真菌细胞壁的主要成分，生防菌株能够产生几丁质、葡聚糖与壳聚糖降解酶，降解真菌细胞壁使其失去生长繁殖能力。几丁质酶是降解几丁质的主要酶，具有多样性，不同微生物可以产生不同种类的几丁质酶[11]。几丁质酶能够破坏真菌菌丝生长，抑制真菌孢子萌发、芽管伸长，使芽管和附着胞解体，在真菌的生防过程中具有重要作用[12]。菌株HG18基因组中发现6个与几丁质降解相关基因(GL000617、GL001507、GL003599、GL000017、GL002074和 GL003784)，GO和KEGG分析显示具有降解几丁质功能，但基因序列与几丁质酶基因差异较大，推测这些基因可能编码一些具有几丁质酶功能的未知蛋白，后续将对这些基因进行功能验证。壳聚糖酶和葡聚糖酶具有抑制病原真菌生长作用，Tomita[13]和Gao等[14]研究表明B.circulasmh-k1和B.cereusD-11产生的壳聚糖酶能够抑制病原真菌生长，将mh-k1中的壳聚糖酶基因转到水稻中，增强了水稻对稻瘟病的抵抗能力[15]。国惠[16]研究发现生防萎缩芽胞杆菌β-1,3-葡聚糖酶具有抑菌功能；李文鹏[17]从芽胞杆菌Bacillussp.HT-7中分离出葡聚糖酶，能够防治棉花黄萎病。孙平平等[18]通过对贝莱斯芽胞杆菌L-1全基因组分析发现，菌株L-1中含有合成fengycin、surfactin、bacillaene、bacillibactin等多种聚酮糖类和肽聚糖抗性化合物的基因簇，以及能够降解病原菌细胞壁的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶相关的基因。本研究基于菌株HG18全基因组数据，挖掘到6个几丁质降解相关基因，2个葡聚糖酶基因和1个壳聚糖酶基因，这些基因均与B.halotoleransXH-1、B.halotoleransZB201702、B.halotoleransF41-3和B.subtilisKKD1 同源性较高，这些基因的挖掘为前期研究发现的菌株抑制多种病原真菌的菌丝生长和孢子萌发提供了参考。

芽胞杆菌能够分泌细菌素和脂肽类抗生素，细菌素subtilin和bacillolysin可以抑制病原细菌生长，脂肽类抗生素表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和芬芥素(Fengycin)能够抑制植物病原真菌。菌株HG18基因组中含有细菌素subtilin和bacillolysin编码基因，推测菌株具有抵抗病原细菌能力。另外，发现Surfactin和Fengycin合成基因簇，Surfactin基因簇大小与B.amylo-liquefaciensTF28相当，比B.amyloliquefaciensFZB42T小，Fengycin基因簇小于B.amyloliquefaciensTF28，没有发现Iturin合成基因簇，推测菌株具有分泌Surfactin和Fengycin的基因基础。本研究基于基因组数据有限信息预测抗菌功能相关基因，对于这些基因的功能还需进行下一步的验证。