miR-17-92基因簇在骨肉瘤中的表达及其临床意义*

林金銮 王发圣 叶君健 吴朝阳 李 祥 林建华

miR-17-92基因簇在骨肉瘤中的表达及其临床意义*

林金銮①王发圣①叶君健①吴朝阳①李 祥②林建华①

目的：探讨人骨肉瘤组织和邻近正常骨组织中miR-17-92基因簇的表达情况及其临床意义。方法：运用Q-PCR法检测63例骨肉瘤组织及邻近部位正常骨组织中miR-17-92基因簇的表达水平，并分析miR-17-92基因簇表达与患者临床病理特征及预后的关系。结果：miR-17-92在所有组织中均有表达，且在肿瘤组织中表达明显高于在正常组织中的表达（P＜0.05），另外，miR-17-92基因簇高表达患者预后更差，差异有统计学意义（P=0.027）。结论：miR-17-92基因簇在骨肉瘤组织和邻近正常骨组织中表达存在差异性，可能在骨肉瘤发生、发展过程中起重要作用，有望成为骨肉瘤患者预后一种新的指标。

miR-17-92基因簇 骨肉瘤 预后

骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤，好发于青少年，恶性程度高，进展迅速，预后差［1］。近年研究表明microRNA（miRNA）作为癌基因或抑癌基因广泛参与肿瘤的发生发展过程，不同肿瘤组织miRNA表达谱不同，肿瘤组织中miRNA的表达可能成为新的肿瘤标志。其中，miR-17-92是一个典型的多顺反子miRNA基因簇。在人类基因组中，miR-17-92位于染色体13q31.3上一个约长7kb的初级转录本C13orf25的第3个内含子上。此编码含有6个成熟的miRNA（miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1）［2］。大量研究表明，miR-17-92基因簇在多种实体瘤中表达明显上调，在肿瘤的发生发展中起到重要作用［3］。本研究采用Q-PCR方法检测miR-17-92基因簇在骨肉瘤组织和邻近正常骨组织中的表达，并探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织来源及试剂材料

1.1.1 组织来源 收集福建医科大学附属第一医院骨科2007年1月至2013年9月经手术切除或者活检取得的63例骨肉瘤组织和邻近正常骨组织标本，所有标本均由本院病理科医生确诊为骨肉瘤。临床病理信息由患者的病历和病理报告获得。其中男性33例，女性30例；年龄6～56岁，平均年龄17.08±13.12岁；Enneking外科分期：Ⅰ期8例，ⅡA期24例，ⅡB期26例，Ⅲ期5例；组织学类型：普通型（包括成骨细胞型、成软骨细胞型、成纤维细胞型等）47例，小细胞型6例，毛细血管扩张型5例，其他类型（骨旁骨肉瘤、未分化型骨肉瘤）5例；骨肉瘤生长部位：股骨34例，胫骨19例，其他部位（包括肱骨等）10例。所有患者均获随访，随访从开始手术至2014年3月，时间1～68个月，平均时间30.89+26.89个月。

1.1.2 主要仪器 LDZ5-2型常温台式离心机（北京医用离心机厂）；Biofuge Stratos高速冷冻离心机（德国Heraeus公司）；HH-4数显恒温水浴箱（常州国华电器公司）；Thermo Forme925型超低温冰箱（美国Thermo公司）；PCR扩增仪（美国Beckman公司）；ABI7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.1.3 主要试剂 Trizol裂解液（美国Invotrogen公司）；miRNA分离试剂盒（美国Invotrogen公司）；miRNA逆转录试剂盒（美国ABI公司）；miR-17-92基因簇引物序列F：5'-CTGTCGCCCAATCAAACTG-3'；R：5'-GTCACAATCCCCACCAAAC-3'）［4］，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及Q-PCR检测 组织样本在液氮中研碎，采用TaqMan miRNA Isolation Kit提取总RNA，应用TaqMan microRNA assay和TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit进行逆转录反应，反应条件为：在20 μL反应体系中进行逆转录；然后将逆转录产物cDNA稀释后，取稀释的cDNA 2 μL与2 μL Taq-Man引物混合，在20 μL反应体系中，95℃10 min变性，随后95℃15 s，60℃60 s，40个循环。

1.2.2 miR-17-92基因簇表达量计算方法 实时荧光定量PCR采用相对定量法：miR-17-92基因簇表达以U6作为内参照，空白对照为基准，待测样品相对值=（2-△△Ct）的平均值±标准偏差，其中△Ct=（目的基因Ct-内参Ct）的平均值±标准偏差；△△Ct=（待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct）的平均值±标准偏差。

1.3 统计学分析

应用SPSS 18.0软件进行统计分析，计量资料比较采用方差分析；计数资料比较采用χ2检验；采用Kaplan-Meier生存分析，Log-Rank检验不同miR-17-92基因簇表达组间生存率的比较，用Cox模型对生存资料进行单因素及多因素分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-17-92基因簇在骨肉瘤组织及相邻正常骨组织中的表达

Q-PCR结果表明63例骨肉瘤组织miR-17-92基因簇表达相对值的平均值为8.36±1.36，其邻近正常骨组织miR-17-92基因簇表达相对值的平均值为6.24±1.57，差异有统计学意义（P＜0.01，图1），且在63例骨肉瘤组织中有51例miR-17-92基因簇的表达高于相邻正常骨组织的表达，提示miR-17-92基因簇在骨肉瘤组织中表达可能与骨肉瘤的发生发展有关。

图1 miR-17-92基因簇在63例骨肉瘤组织和邻近正常骨组织中的表达Figure 1 miR-17-92 cluster expression in 63 pairs of osteosarcoma and adjacent normal bone tissues

2.2 miR-17-92基因簇与骨肉瘤患者临床病理特征的相关性

根据miR-17-92基因簇表达的平均值［5］，63例骨肉瘤患者分为低表达组25例，高表达组38例。统计分析发现miR-17-92基因簇的高表达与肿瘤进展及预后相关，而与患者的性别、肿瘤部位、年龄、病理类型、肿瘤大小、Enneking分期等因素无关（表1）。

2.3 Kaplan-Meier生存分析

25例miR-17-92基因簇低表达组骨肉瘤患者中有8例死亡，平均生存时间为8.12个月，5年生存率为68.0%；38例miR-17-92基因簇高表达组骨肉瘤患者中有23例死亡，平均生存时间为7.04个月，5年生存率为39.5%。从图2中可以看出，miR-17-92基因簇高表达组骨肉瘤患者5年生存率及平均生存时间均低于低表达组，差异具有统计学意义（P=0.008，图2）。

2.4 Cox回归分析

对所有临床病理指标进行单因素Cox回归分析，取P＜0.05的因素再进行多因素回归分析：单因素分析结果显示骨肉瘤患者的miR-17-92基因簇高表达及进展对患者预后均有影响（P＜0.05），进一步行Cox多因素分析结果显示miR-17-92基因簇高表达、进展均是影响骨肉瘤患者预后的独立因素（P＜0.05，表2，3）。

表1 63例骨肉瘤患者miR-17-92基因簇的表达与临床病理参数之间的关系Table 1 Association between miR-17-92 cluster expression and the clinicopathological parameters in 63 osteosarcoma patients

图2 骨肉瘤患者miR-17-92基因簇表达和生存时间之间的关系Figure 2 Correlation between miR-17-92 cluster expression and survival rates in 63 osteosarcoma patients

表2 miR-17-92基因簇及一般临床病理因素在骨肉瘤患者预后中的单因素分析Table 2 Univariate analysis of the associations of prognosis with various clinicopathological parameters and miR-17-92 cluster expression in osteosarcoma

3 讨论

miRNA是近年来发现的一类长度约22个核苷酸非编码小分子RNA，虽然其只占人体基因数的2%，却可以调控30%以上基因的表达［6］。miRNA主要是通过与下游靶基因mRNA 3'-UTR结合，导致靶基因mRNA降解以及抑制转录后的翻译，调控靶基因的表达来发挥作用［7］。

表3 miR-17-92及一般临床病理因素在骨肉瘤患者预后中的多因素分析Table 3 Multivariate analysis of the associations of prognosis with various clinicopathological parameters and miR-17-92 cluster expression in osteosarcoma

已有文献报道［8-12］miRNA在骨肉瘤组织中处于异常状态，一部分miRNA被上调，另一部分miRNA被下调，这些miRNA在肿瘤发生、发展中起癌基因或者抑癌基因的作用。近年来关于miR-17-92基因簇参与调控肿瘤生物学行为的研究已越来越引起重视，一系列研究表明miR-17-92基因簇作为一个重要的转录后调控因子广泛地参与调控多种肿瘤生物学行为相关的基因，同时亦表明miR-17-92基因簇的异常表达与肿瘤的发生发展关系密切［13-14］，而对于miR-17-92基因簇在骨肉瘤组织中的表达情况鲜见报道。

本实验研究结果示miR-17-92基因簇在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于邻近正常骨组织中的表达，差异有统计学意义。同时miR-17-92基因簇的高表达与肿瘤进展及预后相关，而与患者的性别、肿瘤部位、年龄、病理类型、肿瘤大小、Enneking分期等因素无关，这与其在食管癌、髓母细胞瘤等肿瘤中的研究结果一致［5，15-16］。进一步研究显示高表达miR-17-92基因簇的骨肉瘤患者有着更差的预后，经Cox多因素生存分析亦证明miR-17-92基因簇表达是影响骨肉瘤患者预后的独立因素之一，说明miR-17-92基因簇是影响骨肉瘤临床生物学行为的重要因素，对骨肉瘤病情进展及预后有影响，miR-17-92基因簇可能与骨肉瘤的发生发展相关，表明miR-17-92基因簇也可以作为骨肉瘤患者的一个有效预后指标。但是本研究患者肿瘤标本例数有限，随访临床资料的不全等因素，未能更详尽分析其表达变化与术后复发、转移、5年生存率等临床因素之间的相关性，同时miR-17-92基因簇具体是何种编码的miRNA在骨肉瘤发生发展中发挥作用，以及作用于哪些下游靶基因，均是需要进一步研究的内容。

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（2014-08-01收稿）

（2014-10-27修回）

（本文编辑：杨红欣）

Expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma and its clinical significance

Jinluan LIN1,Fasheng WANG1,Junjian YE1,Zhaoyang WU1,Xiang LI2,Jianhua LIN1

1Department of Orthopedics,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005;2Department of Orthopedics,Zhejiang Taizhou No.1 People's Hospital,Taizhou 318000,China

Jianhua LIN;E-mail:jianhual@126.com

Objective:To determine the expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissue samples and explore its association with clinical significance.Methods:Quantitative polymerase chain reactiom analysis was used to examine the expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissues.Normal bone tissues from 63 patients were matched,and the relationships between the expression of miR-17-92 cluster and the clinicopathological features and prognosis of osteosarcoma were explored.Results:The relative expression of miR-17-92 cluster in osteosarcoma tissues was significantly higher than those in adjacent normal tissues(P＜0.05).The high expression of miR-17-92 had a significant correlation with reduced survival(P=0.027).Conclusion:The expression of miR-17-92 cluster closely correlates with the occurrence and progress of osteosarcoma and may be used as an indicator for osteosarcoma prognosis.

miR-17-92 cluster,osteosarcoma,prognosis

10.3969/j.issn.1000-8179.20141243

①福建医科大学附属第一医院骨科（福州市350005）；②浙江省台州市第一人民医院骨科

*本文课题受福建省临床重点专科建设项目和福建医科大学临床医学重点学科（编号：XK201106）资助

林建华 jianhual@126.com

This work was supported by the Clinical Key Subject and Construction Project in Fujian Province and the Fujian Medical University Key Clinical Medical Disciplines(No.XK201106)

林金銮 专业方向为骨肿瘤临床及基础研究。

E-mail：jinluanlin@163.com