酵母PMT1和TED1基因在细胞壁应激反应中的作用

邓雁文, 崔晓静, 刘佳鑫, 黄镇武, 孙恩浩, 方泽森, 王少丹, 周 远, 吕晓彤, 阮 杰，, 王俊芳, 崔红晶，*

(1.广东医科大学 第二临床医学院,广东 东莞 523808; 2.广东医科大学 广东省医学分子诊断重点实验室 衰老研究所,广东 东莞 523808;3.广东医科大学 基础医学院, 广东 东莞 523808;4.广东医科大学 医学技术学院, 广东 东莞 523808)

酿酒酵母细胞处于生长、形态发生或外环境挑战细胞壁完整性的时候，细胞壁以高度调控和极化的方式被重塑，这一过程主要被细胞壁完整性信号通路(Cell wall integrity，CWI)所调控[1]。细胞表面感应因子(如Wsc1-3p、Mid2p 和Mtl1p等)感受到应激信号后，通过传导给小G蛋白(Rho1p)进一步激活丝裂原活化蛋白激酶(The mitogen-activated protein kinase，MAPK)/Slt2p信号级联反应，诱导CWI靶基因转录，改善细胞壁完整性[1]。在调控细胞壁重构的过程中，两个转录后调控因子Mpt5p和Ssd1p，以不依赖MAPK/Slt2p方式参与调控细胞壁的生物合成，或者通过间接机制调控细胞壁重构[2-3]，以适应细胞在生理或环境改变时的生长发育过程。酿酒酵母蛋白质O-甘露糖转移酶(ProteinO-mannosyltransferase，PMT)家族糖基化修饰膜蛋白质和分泌蛋白质，参与调控细胞的多种生物学功能[4]。PMT家族成员中Pmt1p(PMT1基因编码)与Pmt2p(PMT2基因编码)以异聚体的形式存于酵母细胞内，在维持内质网蛋白质的动态平衡方面，以及细胞生长和发育等方面起到重要作用[4]。广东省医学分子诊断重点实验室衰老研究所前期研究结果表明，与Pmt1p-Pmt2p异聚体相结合的内质网伴侣分子Ted1p(Traffcking of Emp24p/Erv25p-dependent cargo disrupted)也参与调控细胞寿命和内质网应激反应，且进一步缺失Pmt1p校正Ted1p的细胞寿命和内质网应激反应方面的表型特征[5-6]。但有关Pmt1p和Ted1p在细胞壁应激反应中的作用研究较少见报道。因此，本研究主要通过检测酵母细胞分裂增殖活性，及细胞壁应激反应信号通路中相关效应蛋白的转录水平，研究缺失PMT1和(或)TED1基因在细胞壁应激反应中的抗性和细胞壁应激反应通路的活性，探讨细胞壁应激反应能力与细胞壁应激反应信号通路活性之间的可能调控关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 单倍体酿酒酵母菌株BY4742(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0)由美国华盛顿大学Matt Kaeberlein博士赠送，单基因缺失酵母菌株(pmt1Δ和ted1Δ)和双基因缺失酵母菌株(pmt1Δted1Δ)为广东医科大学衰老研究所构建[6]。

1.1.2 试剂与仪器 酵母提取物和胰蛋白胨购自广州威佳科技有限公司；刚果红和荧光增白剂购自美国Sigma公司，按照说明书分别配制成100 μg/mL和10 μg/mL的工作液；酵母RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和定量试剂盒均购自TaKaRa公司。实时荧光定量PCR仪(LightCycler96，美国应用生物系统ABI公司)；全自动生长曲线分析仪(Bioscreen C，芬兰Bioscreen公司)；多功能酶标仪(Synergy z BioTek，美国伯腾仪器Bio-Tek有限公司)。

1.1.3 引物 引物由上海英骏生物技术有限公司合成(表1)。

表1 实时荧光定量PCR引物

1.2 方法

1.2.1 点板实验 取等量的酵母菌株新鲜培养物(A600值约为0.25)，无菌水倍比稀释(1∶10)，取3.5 μL稀释培养物滴入实验组YPD培养平板(含10 μg/mL荧光增白剂或100 μg/mL刚果红)[7]。倒置30 ℃培养，从第2天起每隔12 h观察菌落形态并拍照。3次独立重复实验。

1.2.2 生长曲线 实验方法参照文献[8-9]进行。制备300 μL YPD酵母菌株新鲜培养物(含10 μg/mL荧光增白剂或100 μg/mL刚果红)，A600值约为0.04，30 ℃、180 r/min振荡培养24 h；每间隔2 h全自动生长曲线分析仪测定培养物A600值。根据吸光度值，计算酵母菌株的细胞分裂增殖活性并绘制生长曲线图。3次独立重复实验。1.2.3 定量RT-PCR 将酵母菌株培养至对数生长期，收集1 mL新鲜培养物(A600值约为2.5)，提取细胞总RNA、制备cDNA以及实时定量PCR，方法均参照试剂盒说明书进行。定量PCR实验数据以酵母PRP8基因为参比，根据2-ΔΔCT法计算细胞壁应激反应通路中效应蛋白的转录水平。

1.2.4 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件。两组间的比较采用t检验；以P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株在细胞壁应激反应条件下的克隆形成能力

为进一步研究酵母菌株对细胞壁应激反应诱导剂(荧光增白剂或刚果红)的抵抗性，本研究观察pmt1Δ菌株、ted1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株在细胞壁应激反应条件下的细胞克隆形成能力。结果显示：在YPD平板上，与野生型酵母细胞(BY4742)比较，pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株生长状态无明显变化，ted1Δ菌株生长较慢；在含荧光增白剂或刚果红培养条件下，pmt1Δ菌株菌落形成较小，生长较慢，菌株对药物较敏感；ted1Δ菌株细胞生长较快，有明显抗性；但pmt1Δted1Δ菌株的生长受到明显的抑制，表现出敏感性(图1)。因此，缺失TED1基因增强酵母细胞对细胞壁应激反应的抵抗性，进一步缺失PMT1基因增强ted1Δ菌株对细胞壁应激反应的敏感性。

图1 酵母菌株在细胞壁应激反应条件下的克隆形成能力

2.2 酵母菌株在细胞壁应激反应条件下的增殖活性

通过检测细胞增殖情况，进一步研究pmt1Δted1Δ菌株对细胞壁应激反应诱导剂的抵抗性。结果显示：在YPD液体培养条件下，与菌株BY4742平均约9 h达到对数生长期比较，pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株的生长状态无明显差异，而ted1Δ菌株的生长曲线低平，细胞生长活力较差，约10.5 h达到对数生长期；在含10 μg/mL荧光增白剂培养条件下，与BY4742酵母细胞平均约17 h达到对数生长期比较，pmt1Δ菌株的生长缓慢(平均约19 h达到对数生长期)；ted1Δ菌株的生长状态较好(约14 h达到对数生长期)，pmt1Δted1Δ菌株生长曲线低平，细胞活力最差，约26 h达到对数生长期；在含100 μg/mL刚果红培养条件下，各菌株的细胞增殖能力情况与荧光增白剂培养条件下的结果相似(图2)。因此，细胞壁应激反应诱导剂影响菌株BY4742、pmt1Δ菌株、ted1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株的细胞分裂增殖能力，与对照组比较，ted1Δ菌株的生长状态较好，但pmt1Δted1Δ菌株的生长受明显抑制。

图2 酵母细胞生长曲线

2.3 细胞壁应激反应通路中效应蛋白在酵母菌株中的转录表达水平

为研究pmt1Δ菌株、ted1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株参与细胞壁应激反应通路的可能机制，本文采用定量qRT-PCR检测参与细胞壁结构和完整性调控通路Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效应蛋白基因转录水平。结果显示：与BY4742比较，pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株中SLT2、MPT5和SSD1基因表达明显升高，ted1Δ菌株中的基因表达水平无明显变化；与pmt1Δ菌株比较，pmt1Δted1Δ菌株中SLT2和MPT5基因表达明显下调，SSD1基因表达无明显变化(见图3)。

图3 酵母菌株SLT2、SSD1和MPT5基因转录表达水平

因此，缺失PMT1上调野生型酵母细胞和ted1Δ菌株中细胞壁应激反应通路Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效应蛋白的转录水平。

3 讨 论

酵母细胞壁对维持细胞形状和完整性，以及促进细胞周期发生等生物学过程至关重要。当细胞内外物理化学环境发生改变时，诱导经典细胞壁完整性(CWI)信号通路中蛋白激酶C-丝裂原活化蛋白激酶(PKC-MAPK)的激活，效应蛋白Slt2p是这一信号通路中的重要成份，参与下游靶基因的转录调控[2]，进一步增加转录因子Rlm1p的表达水平，调控β-葡聚糖和细胞壁相关成分转录，重构细胞壁，赋予细胞壁应激反应抵抗能力[1，10]。与经典CWI通路相平行的Mpt5p和Ssd1p两条信号通路也参与调控细胞壁生物合成相关基因的转录或转录后加工，三条信号通路协同调控细胞壁结构和细胞的完整性[2-3]。

通过研究缺失PMT1和(或)TED1基因在酵母细胞壁应激反应中的作用，进而探讨酵母细胞壁应激反应能力与细胞壁应激反应信号通路之间的调控关系。结果显示，已知长寿命pmt1Δ菌株对细胞壁应激反应诱导剂敏感，生长较慢，形成较小克隆，这提示蛋白质O-甘露糖基化修饰功能在细胞壁硬度和细胞完整性方面有着重要作用[11]。本研究进一步发现缺失PMT1基因诱导细胞壁应激反应通路中效应蛋白SLT2、MPT5和SSD1基因表达上调，这与以往研究结果PMT抑制剂能诱导CWI信号通路的活性相一致[11]。但是上调的保护性CWI信号通路没有赋予pmt1Δ菌株对细胞壁应激反应的抵抗性，推测可能原因与蛋白质甘露糖基化修饰功能缺陷影响PKC-MAPK信号通路的功能，进而影响细胞壁的完整性相关；另外，药物刺激之后，细胞壁应激反应水平过高，超出pmt1Δ细胞可以承受的范围，细胞壁重塑功能紊乱，对细胞造成生理毒性。pmt1Δ菌株在正常生理条件下的良好生长状态也说明过高的细胞壁应激反应水平导致细胞损伤这一推测的可能性。

同时，本研究还发现细胞壁应激反应诱导剂对ted1Δ菌株和对照组酵母细胞的生长均有抑制作用，对后者的生长抑制更加显著，说明缺失TED1基因增强酵母细胞对细胞壁应激反应的抵抗性，提示Ted1p参与细胞壁硬度和(或)细胞完整性的调控。进一步定量PCR结果显示，ted1Δ菌株中细胞壁应激反应信号通路中效应蛋白Slt2p、Ssd1p和Mpt5p转录表达水平无明显变化，推测细胞壁应激反应信号通路的活性可能更适合ted1Δ菌株在细胞壁应激反应条件下的生长；或者突变的钾离子通道改变ted1Δ菌株细胞壁的通透性，影响药物渗入，从而避免细胞损伤。已有研究报道Ted1p在调控酵母细胞壁稳定性、细胞生长和分裂等生理过程中具有重要的作用[4,13-14]，推测其他信号通路可能也会间接地参与ted1Δ菌株在细胞应激条件下的细胞壁重构功能。但是，缺失TED1基因增强酵母细胞对细胞壁应激反应抵抗性的具体机制还需要进一步研究。

值得注意的是，细胞壁应激反应诱导剂显著抑制pmt1Δted1Δ菌株的生长，提示缺失PMT1基因增强ted1Δ菌株对细胞壁应激反应的敏感性；且pmt1Δted1Δ菌株诱导细胞壁应激反应信号通路中效应蛋白Slt2p、Ssd1p和Mpt5p转录表达水平上调，结果提示pmt1Δted1Δ菌株参与细胞壁应激反应信号通路的调控，但诱导的PKC-MAPK、Mpt5p和Ssd1p三条保护性信号通路没有赋予pmt1Δted1Δ菌株对细胞壁应激反应的抵抗性。推测缺失PMT1基因消弱ted1Δ菌株的细胞壁稳定性或细胞壁通透性，进而影响酵母细胞的生长、分裂和其他生物学反应[4,12-14]。可能原因与缺失Pmt1p和Ted1p影响蛋白质O-甘露糖基化修饰功能，进而干扰酵母细胞壁重构，影响细胞的分裂增殖能力相关，或者Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效应蛋白转录水平上调表达不足以修复酵母细胞受到的细胞壁应激损伤。总之，pmt1Δted1Δ菌株对细胞壁应激反应诱导剂敏感的具体机制有待进一步研究。

本研究发现已知长寿命pmt1Δ菌株和pmt1Δted1Δ菌株中细胞壁应激反应信号通路Slt2p、Ssd1p和Mpt5p等效应蛋白转录水平表达上调，已知短寿命ted1Δ菌株中效应蛋白的转录水平无明显变化。研究结果提示，上调的保护性信号通路没有赋予菌株对细胞壁应激反应的抵抗性，说明细胞分裂增殖能力与应激反应通路之间的关系较为复杂，这取决于细胞应激反应类型、胁迫程度和调节细胞分裂增殖能力通路等多因素的协同作用。因此，突变菌株对细胞壁应激反应抵抗性的具体作用机制有待进一步研究。

致谢：感谢美国华盛顿大学Matt Keaberlein博士和美国BUCK衰老研究所Brian K Kennedy博士赠送的菌株BY4742，及在酵母实验技术方面给予的精心指导。