固始鸡和AA肉鸡肝脏中脂肪酸合成酶基因表达及肌肉脂肪酸的比较研究

王明发,王浩宇,王浩,袁林*

(1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所,河南 郑州 450002;2.舞钢市鸿发禽业有限公司,河南 舞钢 462500)

鸡体脂肪主要沉积在腹部、皮下和肌肉组织等部位[1-2]。肌内脂肪(IMF)主要分布在肌表层、肌周和肌内膜,是评价肉品质的重要指标。一定量的IMF可以提高肌肉的风味和嫩度等品质[3-8],IMF含量增加可减少肌肉滴水损失和蒸煮损失,因而改善肉质[9]。因此需要对肌内脂肪沉积的分子机制进行研究。脂肪酸是机体重要的能量来源,多余的脂肪酸可以作为脂肪在体内储存。在现代肉鸡养殖中,机体内脂肪沉积过多是养殖者关注的问题。因为肉鸡体内脂肪沉积过多,不仅导致饲料效率下降,而且大部分脂肪作为边角料在屠宰和加工过程中被舍弃,造成浪费[10]。哺乳类单胃动物多数脂肪酸的合成开始于脂肪组织,而鸡的脂肪代谢则不同,脂肪组织中很少甚至几乎没有脂肪酸合成,脂肪组织中90% 以上的脂肪酸是在肝脏中合成的[10-12]。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的关键多功能酶[13]。动物体内FASmRNA表达水平与体脂含量呈正相关[14]。组织中脂肪酸合成的最高水平由FASmRNA表达水平决定[15]。在猪和大鼠等哺乳动物中,已有一些关于IMF含量和FASmRNA表达水平之间关系的研究[5,16-18]。然而,鸡FASmRNA的表达模式及其与IMF和脂肪沉积的关系尚不清楚。固始鸡是我国著名的地方鸡种,具有生长缓慢、肉质优良的特点,AA肉仔鸡是快速生长肉仔鸡的代表。相关研究表明,8周龄固始鸡胸肌中IMF含量显著高于AA肉鸡,但腿肌中含量没有显著差异[19],而不同周龄AA肉鸡和固始鸡肝脏中FASmRNA表达及活性的研究还鲜见报道。花生四烯酸作为一种重要的风味物质,其含量显著影响鸡肉品质。本研究通过测定不同周龄AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中的IMF含量及脂肪酸组成,研究固始鸡和AA肉鸡不同周龄肝脏中脂肪酸合成酶活性及FASmRNA表达的规律,对于阐明固始鸡高品质鸡肉形成的分子机制具有重要意义,同时也为固始鸡日粮中脂肪配比水平的调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物、日粮和分组

选取1日龄快长型D系固始鸡(固始三高集团提供)和AA肉鸡(购自开封正大种鸡场)公雏各200只,每个品种的雏鸡随机分成5个重复,每个重复40只鸡。选用玉米-豆粕型日粮,分1～4周龄和5～6周龄2个饲养阶段,营养水平参照美国营养研究委员会(1994)肉仔鸡的营养需要配制日粮,基础日粮组成及营养水平见表1。鸡群饲养和免疫按正常程序进行,保证充足光照时间,试验鸡用笼具为不锈钢材料,饲槽和饮水设备为塑料制品。

表1 不同饲养阶段基础日粮组成及营养组成水平(风干基础)Table 1 Basic diet composition and nutrient composition at the different feeding stages(air-dry basis) %

1.2 采样

试验开始第1天取样(设为0周龄),然后分别在3、4、5和6周龄不禁食状态下(禁食会影响FAS水平)从每个重复中随机抽取体重相近的3只鸡颈部放血宰杀,采集约1 g肝样置于冻存管中,液氮速冻,然后转入-80 ℃保存,用于测定FASmRNA表达水平。其余肝脏样本装入聚乙烯袋中,封口,于-20 ℃保存,用于分析FAS活性。采集4和6周龄左侧胸肌和腿肌样本,-20 ℃保存,用于测定肌肉中脂肪酸组成和脂肪含量。

1.3 胸肌和腿肌中IMF含量的测定

取每个肌肉样品约2 g,先去除明显的脂肪,解冻后切碎,65 ℃干燥12 h后转至105 ℃继续干燥12 h,然后在干燥器中冷却30 min,以无水乙醚为溶剂,采用索氏抽提法测定腿肌和胸肌中脂肪含量。

1.4 肝脏中FAS活性的测定

用 FAS酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定肝脏中FAS活性。称取 -20 ℃保存的肝脏组织10 mg,加入100 μL 9 g·L-1生理盐水中,捣碎、匀浆,以3 000 r·min-1离心10 min,取上清液备用。标准品孔加入不同浓度的标准品溶液50 μL;在酶标包被板孔中先加样品稀释液40 μL,再加待测样品10 μL;除空白外,每孔加入酶标试剂100 μL;用封板膜封板后37 ℃温育60 min;洗涤液洗涤 5次,甩干;每孔先加入显色剂A 50 μL,再加入显色剂B 50 μL,37 ℃避光显色15 min;每孔加终止液 50 μL,终止反应;用酶标仪(Infinite F50)在450 nm波长下测定吸光值(A450值),计算样品脂肪酸合成酶活性(U·mg-1)。

1.5 肝脏中FAS mRNA水平的测定

取-80 ℃冰箱中保存的肝脏组织约100 mg,用Trizol试剂提取RNA,用紫外分光光度计测定D260、D280值并计算D260/D280值,计算RNA的纯度和浓度,琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的质量。取4.782 μg样品RNA,在20 μL的反应体系中42 ℃反应60 min,逆转录成cDNA。从GenBank中查找FAS和β-actinmRNA的全序列,设计基因引物序列:β-actin(161 bp):5′-AGAAGGAGATCACAGCCCT-3′/5′-GGGTCCGGATTC-ATCGTACT-3′;FAS(119 bp):5′-GGACCTTATCGCATTGCTGG-3′/5′-TTTCCTTGGGTCAGCTTTGC-3′。由武汉巴菲尔(Biobuffer)生物技术有限公司合成。

RT-qPCR检测(25 μL反应体系):0.5 μL内参 F(10 μmol·L-1),0.5 μL内参 R(10 μmol·L-1),2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1),0.25 μLExTaq,2.5 μL 10×ExTaqE 缓冲液,1 μL cDNA,18.25 μL ddH2O。反应条件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,30个循环;72 ℃ 4 min。RT-qPCR检测时,cDNA 6倍稀释,20 μL反应体系如下:4 μL cDNA(6倍稀释),0.4 μL上游引物(100 μmol·L-1),0.4 μL下游引物(100 μmol·L-1),10 μL SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix,5.2 μL ddH2O。反应条件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40个循环。以0.5 ℃·s-1从60 ℃升温至95 ℃,绘制熔解曲线,再以2-ΔΔCT法进行分析。

1.6 胸肌和腿肌中脂肪酸组成测定

胸肌和腿肌中脂肪酸组成的测定采用《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定GB 5009.168—2016》第三法。

1.7 统计分析

采用SPSS 22.0软件中的混合线性模型对肝脏中FASmRNA表达水平、FAS活性及肌肉中IMF含量进行分析。品种、周龄和品种×周龄作为固定效应,鸡作为随机效应,以周龄作为重复测量,鸡肝脏中FASmRNA表达水平、FAS活性及肌肉中IMF含量作为协变量。由于某些脂肪酸在特定组织中的含量未测出,因此,只对胸肌和腿肌中部分脂肪酸采用t测验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同周龄AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS mRNA表达水平分析

从表2可以看出:AA肉鸡肝脏中FASmRNA表达水平显著高于固始鸡。品种与周龄互作对表达水平产生极显著影响,对相同周龄FASmRNA表达水平比较发现,0、3和5周龄时,AA肉鸡肝脏中FASmRNA表达水平显著高于固始鸡,而4和6周龄时品种间没有显著差异。

2.2 不同周龄AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS活性分析

从表3可以看出:AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS活性没有显著差异。品种与周龄互作对FAS活性产生极显著影响,对相同周龄FAS活性比较发现,在0、3和和5周龄时,AA肉鸡显著高于固始鸡,4和6周龄时,品种间没有显著差异,这与FASmRNA表达水平相一致;从0 到5周龄,AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS活性没有显著变化,6周龄时两品种肉鸡肝脏中FAS活性显著提高。

表3 不同周龄AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS活性Table 3 Liver FAS activity of AA broiler and Gushi chicken of different week-age

2.3 不同周龄AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中IMF含量分析

从表4可以看出:AA肉鸡胸肌和腿肌中IMF含量极显著高于固始鸡。品种与周龄互作对胸肌中IMF含量产生显著影响,对腿肌中IMF含量不产生显著影响。对相同周龄IMF含量比较发现,4周龄时,AA肉鸡胸肌和腿肌中IMF含量均显著高于固始鸡;6周龄时,AA肉鸡胸肌和腿肌中IMF含量与固始鸡没有显著差异。

表4 不同周龄AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中IMF含量Table 4 IMF contents in breast and leg muscles of AA broilers and Gushi chicken of different week-age

2.4 不同周龄AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中脂肪酸组成分析

从表5可以看出:相同周龄AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中脂肪酸总含量没有显著差异。脂肪酸组成方面品种间呈现显著差异,无论是胸肌还是腿肌,固始鸡多不饱和脂肪酸含量显著高于AA肉鸡;4周龄固始鸡胸肌和腿肌中亚油酸含量显著高于AA肉鸡,6周龄时差异不显著;4周龄时AA肉鸡胸肌中亚麻酸含量显著高于固始鸡,腿肌中没有显著差异,6周龄时AA肉鸡胸肌和腿肌中亚麻酸含量显著高于固始鸡,4和6周龄时固始鸡胸肌和腿肌中花生四烯酸含量显著高于AA肉鸡。随着周龄增加,AA肉鸡胸肌和腿肌中多不饱和脂肪酸含量没有显著变化,而固始鸡含量显著降低;AA肉鸡4周龄胸肌和腿肌中亚油酸含量与6周龄没有显著差异,而固始鸡胸肌和腿肌中亚油酸含量随着周龄增加显著降低;与4周龄相比,6周龄AA肉鸡胸肌中亚麻酸含量显著提高,腿肌中没有显著变化,固始鸡胸肌中亚麻酸含量没有显著差异,而腿肌中含量显著降低;AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中花生四烯酸含量随周龄增加均无显著变化。

表5 不同周龄AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中脂肪酸组成Table 5 Fatty acid composition in breast and leg muscles of AA broiler and Gushi chicken of different week-age(w)

3 讨论

3.1 AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS mRNA表达水平

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的关键酶,在鸡肝脏中以复杂的七步反应将乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A合成长链脂肪酸。FAS活性和表达水平与雏鸡肝脏中脂肪酸合成的速度有关,FASmRNA表达量的变化直接与FAS蛋白的合成速度正相关[20-22]。本研究结果显示,AA肉鸡肝脏中FASmRNA表达水平显著高于固始鸡;0、3和5周龄时AA肉鸡肝脏中FASmRNA表达水平显著高于固始鸡,4和6周龄时尽管差异不显著,但AA肉鸡的表达水平有高于固始鸡的趋势,这与Zhao等[23]的结果一致。此外,Daval等[24]和Douaire等[25]报道,遗传性多脂系和瘦型系肉鸡的FASmRNA表达水平存在差异,但由于个体间的变异系数较大,统计学上的差异不显著。

3.2 AA肉鸡和固始鸡肝脏中FAS活性

本研究结果表明,在0、3和5周龄时,AA肉鸡肝脏中FASmRNA表达水平显著高于固始鸡,同阶段AA肉鸡肝脏中FAS活性亦显著高于固始鸡;4和6周龄时AA肉鸡的表达量与固始鸡没有显著差异,FAS活性表现出相同趋势。这与Richard等[26]的研究结果一致,肝脏中FASmRNA表达量与FAS活性间呈正相关关系。

3.3 AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中IMF含量差异与FAS mRNA表达水平的关系

肌间脂肪含量直接影响肉品风味、多汁性和口感,是判定肉质的重要指标;在影响IMF的众多因素中,遗传因素对IMF含量影响较大。本研究中,4周龄时AA肉鸡胸肌和腿肌中IMF含量显著高于固始鸡,6周龄时AA肉鸡胸肌和腿肌中IMF含量与固始鸡没有显著差异。这与王志祥等[19]的研究结果不同,他们测定了8周龄艾维茵肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中IMF含量,发现固始鸡胸肌中IMF含量显著高于艾维茵肉鸡,而腿肌中没有显著差异,可能与测定的周龄有关。从4周龄到6周龄,AA肉鸡胸肌和腿肌中IMF含量显著降低,而固始鸡腿肌中IMF含量没有显著变化,这可能与2个品种肉鸡在此生长阶段内的增重速率有关,AA肉鸡在4周龄到6周龄期间绝对增重为1 120 g,而固始鸡只有598 g[27],脂肪沉积速度低于增重速度,随着饲养周期延长,固始鸡胸肌和腿肌中IMF含量可能会高于AA肉鸡。

本研究中,与4周龄相比,6周龄时除固始鸡的腿肌中IMF含量增加外,AA肉鸡胸肌、腿肌和固始鸡胸肌中IMF含量均显著降低,这与肝脏中FAS活性及mRNA水平的变化并不一致,可能与不同周龄的鸡IMF变化滞后于肝脏FAS活性的变化有关。机体利用能量等合成脂肪的能力是逐渐增加的,而前期由于生长发育的需要,鸡肉脂肪沉积较少[28],只有当脂肪酸的摄取速度大于脂肪酸氧化速度时,脂质才会在肌肉组织中进行沉积,从而形成IMF[29]。脂肪在机体组织内的沉积与分配主要受到激素和脂肪代谢相关酶活性的调控,肝脏是家禽合成脂肪的主要部位,家禽90% 以上的脂肪酸在肝脏内合成,因此肝脏内脂肪代谢酶活性的高低直接影响了脂肪在组织内的沉积与分配,鸡肝脏内FAS活性虽然对肌肉IMF含量具有重要作用,但这在90～200日龄的生长阶段更为明显[30]。有研究表明河田鸡、乌鸡和北京油鸡在8～16周龄阶段胸肌和腿肌IMF含量会随着周龄的增加而显著升高[31]。AA肉鸡与北京油鸡在28～90日龄阶段胸肌和腿肌IMF含量也随日龄的增加呈上升趋势[28]。

3.4 AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中脂肪酸组成差异

鸡肉中脂肪酸组成直接影响鸡肉的风味。研究发现,花生四烯酸是前列腺素和凝血酶的前体,可影响血凝和愈合过程,同时在幼儿生长中也扮演着重要的角色[32];亚麻酸和亚油酸对人体起着至关重要的作用,但都必须直接摄入,无法在体内合成[33]。本研究中,AA肉鸡、固始鸡胸肌和腿肌中脂肪酸总量没有显著差异,但相同周龄时,固始鸡胸肌、腿肌中亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸总量显著高于AA肉鸡。花生四烯酸为鸡肉中最重要的香味前体物质之一,4周龄时,固始鸡胸肌和腿肌中花生四烯酸含量分别为AA肉鸡的2.09、4.03倍,6周龄时为分别为3.17和3.91倍,这可能是固始鸡具有特殊风味的重要原因。

综上,品种间FASmRNA表达水平及FAS活性的差异可能是造成肉鸡生长前期IMF含量显著不同的原因之一;胸肌和腿肌中多不饱和脂肪酸,特别是花生四烯酸含量可能是影响固始鸡鸡肉风味的重要因素。