白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏抗氧化功能和Nrf2通路相关基因表达的影响

张成,王驰,王孝成,赵菲,耿照玉

(安徽农业大学动物科技学院,安徽 合肥 230036)

高温是制约畜禽生产的关键有害环境因子之一。家禽没有汗腺,全身被羽毛覆盖,不易散热,更容易受到环境高温的影响。环境高温导致家禽内分泌和免疫功能紊乱[1-2],进而导致其生长发育受阻,死亡率升高,造成巨大的经济损失[1,3]。如何缓解热应激及其作用机制成为国内外学者的研究热点之一。研究表明,营养调控是缓解热应激的有效手段。白藜芦醇作为一种广泛存在于虎杖、花生等多种植物中的天然多酚类化合物,具有抗炎、调节能量代谢等多种生物学功能[4-6]。白藜芦醇可以调节血液中物质代谢,维持动物体内稳态,减缓热应激的负面影响[7-8]。在大鼠上的研究表明,在机体物质代谢、免疫及解毒等方面均发挥重要作用的肝脏易遭受热应激导致的氧化应激,而白藜芦醇对其具有缓解作用[9]。笔者所在实验室前期研究表明,饲粮中添加白藜芦醇可显著缓解热应激对肉鸡生长性能和抗氧化能力的负面作用[6,8],但其分子机制有待探究。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作为抗氧化系统中重要的转录因子,对调节机体抗氧化能力具有至关重要的作用[10-11]。白藜芦醇可提高Nrf2表达,从而激活其下游抗氧化基因的表达,进而提高机体抗氧化能力,清除自由基,缓解氧化应激损伤[12]。据此,我们推测白藜芦醇是通过调控热应激肉鸡Nrf2信号通路相关基因的表达,进而提高抗氧化能力,从而发挥其缓解热应激负面作用的功能。因此,本试验探究饲粮添加白藜芦醇对热应激肉鸡生长性能、免疫器官指数、血清生化指标的影响,重点考察其对热应激肉鸡肝脏抗氧化能力及Nrf2信号通路关键基因表达的调控模式,为白藜芦醇作为功能性饲料添加剂在家禽生产中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲粮

试验选取1日龄爱拔益加(Arbor Acres,AA)雄性肉仔鸡300羽,常规饲养及免疫。21日龄时,选取体重相近的肉鸡54羽,随机分为3组:对照组、热应激组和热应激+白藜芦醇组,每组3个重复,每个重复 6羽。对照组和热应激组饲喂基础饲粮,热应激+白藜芦醇组在基础饲粮中添加400 mg·kg-1白藜芦醇[13]。试验期间自由采食饮水。对照组室温控制为(22±1)℃;每日08:00至18:00,热应激组和热应激+白藜芦醇组室温控制(33±1)℃,其余时段温度与对照组一致(升、降温均在15 min内完成)。环境相对湿度约为70%(利用加湿器控制室内湿度)。试验期21 d。白藜芦醇(Celex Laboratories Inc.)纯度大于98%。基础饲粮组成及营养水平见表1[14-16]。

表1 基础饲粮原料组成及营养组成水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis) %

1.2 样品采集与处理

试验结束前12 h停止喂料,试验结束时试验鸡称重,每个重复选取接近平均体重的试验鸡2羽,翅静脉采血3 mL,3 000 r·min-1离心15 min,分离血清,置于-20 ℃保存待测。试验鸡采血后屠宰,采取肝脏样品,装入灭菌冻存管中,液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存待测。

1.3 生长性能指标测定

分别于试验开始和结束时,称取肉鸡空腹初始体重和终末体重,统计试验期间总采食量,计算试验肉鸡平均日增重(average daily gain,ADG)、平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料重比(F/G)。

1.4 器官指数测定

摘取肝脏、脾脏、法氏囊和胸腺,称重,按以下公式计算器官指数。

器官指数(g·kg-1)=器官重(g)/体重(kg)。

1.5 血清生化指标测定

血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性和总蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、葡萄糖(glucose,GLU)、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)及低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)含量测定均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒。

1.6 抗氧化指标测定

肝脏中过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、谷胱甘肽疏基转移酶(glutathioneS-transferase,GSH-ST)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和蛋白质羰基(protein carbonyl,PC)含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。样品制备:称取1 g肝脏组织,按质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例,加入预冷的生理盐水,在冰浴条件下机械匀浆,制成10%的匀浆液,于4 ℃条件下3 000g离心10 min,取上清液进行测定。

1.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定

肝脏组织中总RNA使用Trizol试剂(Thermo Fisher Scientific,USA)提取。采用Hifair®Ⅱ第1链(Yeasen,中国)试剂盒进行反转录,得到cDNA模板。用Hieff®荧光定量试剂盒(Yeasen,中国)和ABI 7500荧光定量PCR仪进行PCR反应。反应体系及反应条件参照荧光定量试剂盒。以β-actin为内参基因,目的基因的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCT法计算。所有引物由安徽通用生物科技有限公司合成,序列见表2。

表2 Nrf2信号通路相关基因的引物序列Table 2 Primers sequences of Nrf2 Signaling pathway-related genes

1.8 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇对热应激肉鸡生长性能的影响

由表3可知:与对照组相比,热应激组肉鸡的终末体重、ADG和ADFI显著降低(P<0.05),F/G显著升高(P<0.05);与热应激组相比,热应激+白藜芦醇组肉鸡终末体重和ADG(P<0.05)显著提高,F/G显著降低(P<0.05)。

表3 白藜芦醇对热应激肉鸡生长性能的影响(n=3)Table 3 Effects of resveratrol on growth performance of heat-stressed broilers

2.2 白藜芦醇对热应激肉鸡器官指数的影响

由表4可知:与对照组相比,热应激组肉鸡肝脏、脾脏及胸腺指数显著下降(P<0.05);与热应激组相比,热应激+白藜芦醇组肉鸡脾脏及胸腺指数显著提高(P<0.05)。

表4 白藜芦醇对热应激肉鸡器官指数的影响(n=6)Table 4 Effects of resveratrol on organ indexes of heat-stressed broilers g·kg-1

2.3 白藜芦醇对热应激肉鸡血清生化指标的影响

由表5可知:与对照组相比,热应激组肉鸡血清中ALT活性和TG、TC含量显著升高(P<0.05),GLU和TP含量显著降低(P<0.05);与热应激组相比,热应激+白藜芦醇组肉鸡血清中ALT活性显著降低(P<0.05),GLU和TP含量显著升高(P<0.05)。

2.4 白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏抗氧化指标的影响

由表6可知:与对照组相比,热应激组肉鸡肝脏中CAT、GPX、GSH-ST和 SOD活性显著降低(P<0.05),MDA和PC含量显著上升(P<0.05);与热应激组相比,热应激+白藜芦醇组肉鸡肝脏中GPX和SOD活性显著升高(P<0.05),MDA含量显著下降(P<0.05)。

表6 白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏抗氧化指标的影响(n=6)Table 6 Effects of resveratrol on antioxidant index in liver of heat-stressed broilers

2.5 白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏Nrf2信号通路相关基因表达的影响

由表7可知:与对照组相比,热应激组肉鸡肝脏Nrf2、HO-1和SOD1基因mRNA表达量显著降低(P<0.05),而Keap1基因mRNA表达量显著升高(P<0.05);与热应激组相比,热应激+白藜芦醇组肉鸡肝脏Nrf2、HO-1和SOD1基因mRNA表达量显著升高(P<0.05),而Keap1基因mRNA表达量显著下降(P<0.05)。

表7 白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏Nrf2信号通路相关基因mRNA表达的影响(n=6)Table 7 Effects of resveratrol on the expression of Nrf2 signaling pathway-related genes in liver of heat-stressed broilers

3 讨论

3.1 白藜芦醇对热应激肉鸡生长性能的影响

热应激导致肉鸡生理状态失衡,抗氧化性能降低,免疫功能下降,是限制肉鸡生产的重要环境因子[17-18]。前人研究表明,热应激会降低肉鸡终末体重和ADFI[5];Zhang等[19]试验结果也表明,肉鸡在高温条件下终末体重和饲料转化率均显著下降。本试验结果显示,热应激诱导肉鸡生产性能显著下降。这可能是因为热应激对消化系统、内脏器官供血不足,进而影响其生长及生理功能[20]。研究表明,热应激导致的肉鸡生产性能下降可通过营养调控来缓解[5,21]。本试验结果表明,热应激组肉鸡终末体重、ADG、ADFI和饲料转化效率较对照组显著降低,而在饲粮中添加白藜芦醇能有效缓解热应激对肉鸡生产性能造成的不利影响,这与Liu等[5]在乌骨鸡上的研究结果一致。

3.2 白藜芦醇对热应激肉鸡免疫器官指数的影响

法氏囊、胸腺、肝脏和脾脏是家禽最为重要的免疫器官,参与其细胞和体液免疫过程,免疫器官的生长和发育是维持免疫功能的基础。热应激对免疫器官的发育造成不利影响,并造成肉鸡免疫功能损伤[5-6]。Liu等[5]研究发现,热应激导致肉鸡法氏囊和脾脏器官指数显著下降。已证实免疫功能损伤可通过营养来调控。本试验结果表明,相比对照组,热应激组肉鸡肝脏、脾脏和胸腺的器官指数均显著降低,而饲粮中添加白藜芦醇显著提高了热应激肉鸡胸腺和脾脏的器官指数,这提示白藜芦醇可改善热应激对肉鸡免疫功能的不利影响。

3.3 白藜芦醇对热应激肉鸡血清生化指标的影响

血清酶活性的高低直接与相应组织器官代谢水平的功能状态相关[22]。ALT和AST是反映鸡应激状态较为敏感的指标,也是肝脏细胞功能酶,当肝细胞受损时,细胞膜通透性增加,胞浆内的ALT和AST释放入血[23]。本试验结果显示,热应激导致血液ALT活性显著升高,说明热应激可能对肝脏细胞及其功能造成损伤,这与郝生燕等[22]的研究结果相符;而饲粮中添加白藜芦醇显著降低了热应激肉鸡血清ALT活性,说明白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏具有保护作用。除了血清中多种代谢酶,热应激还会影响其他代谢物质的含量。TP是反映机体蛋白质合成效率的重要指标,GLU含量变化可反映机体对碳水化合物的利用率[24],热应激导致肉鸡血清中GLU[8]和TP[25]含量降低。张彩云等[26]研究表明,白藜芦醇可显著影响肉鸡血清生化指标。本研究发现,饲粮中添加白藜芦醇可有效缓解热应激对肉鸡血液中TP和GLU含量的影响,说明白藜芦醇可有效缓解热应激对肉鸡机体蛋白质和糖代谢的影响。TG的来源主要分为内源性和外源性,而内源性TG主要在肝脏中合成。本实验室Zhang等[8]研究发现,热应激会显著提高肉鸡血清中TG含量;He等[25]报道,饲粮中添加350、500 mg·kg-1的白藜芦醇显著降低热应激肉鸡血清中TG含量。本试验结果表明,热应激引起肉鸡血清TG含量显著升高,而在饲粮中添加白藜芦醇可显著降低热应激肉鸡血清中TG含量,这提示白藜芦醇可有效调节热应激对肉鸡脂质代谢的影响。据报道,白藜芦醇抑制热休克蛋白(heat shock proteins,HSP)基因的表达[5],而HSP可能通过改善胰岛素敏感性来增强胰岛素功能[27]。因此,白藜芦醇可能通过提高胰岛素敏感性,导致糖酵解和脂肪合成,调节了热应激肉鸡血清中GLU和TG的含量。

3.4 白藜芦醇对热应激肉鸡肝脏抗氧化能力和Nrf2通路相关基因的影响

高温环境会破坏动物机体氧化还原平衡,导致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量聚集,引起脂质和蛋白质氧化及DNA损伤,最终诱发氧化应激[12,28]。热应激导致肉鸡肌肉ROS含量显著提高[19],这可能是导致肌肉中MDA和PC含量显著增加的原因[29-30]。白藜芦醇具有很好的亲脂性并具有特殊的多酚结构,能有效清除自由基,并抑制机体内二硫化谷胱甘肽的形成,保持谷胱甘肽的还原状态,抑制自由基的形成,保护机体免受氧化应激损伤[31]。Zhang等[6,8]研究发现,饲粮中添加白藜芦醇显著降低热应激肉鸡脾脏和肌肉中MDA含量。本研究发现,与对照组相比,热应激组肉鸡肝脏中MDA和PC含量显著提高,而饲粮添加白藜芦醇可显著降低肝脏中MDA含量,说明白藜芦醇可有效缓解热应激诱发的氧化损伤,但其作用机制需进一步探究。

动物机体氧化还原平衡可通过多种抗氧化酶维持[29]。Liu等[5]研究发现,高温条件下,肉鸡血清中GPX、SOD和CAT活性显著降低;Zhang等[6]研究发现,热应激会引起肉鸡脾脏CAT和T-SOD活性下降;本研究结果与上述结果一致,说明热应激损害了肉鸡酶促抗氧化系统。Nrf2是调控机体抗氧化能力的重要转录因子,调节着SOD、CAT、HO-1、GST、GR和GPX等多种抗氧化酶的表达,对于维持机体氧化还原平衡至关重要,而Keap-1对Nrf2的转录活性具有关键调节功能[12,28]。前期研究发现,热应激显著降低了肉鸡脾脏中Nrf2、GPX、锰超氧化物歧化酶(manganese-containing superoxide dismutase,MnSOD)和HO-1mRNA表达量[6];此外,Sahin等[3]研究发现,热应激显著降低肉鸡肌肉中Nrf2蛋白表达水平以及SOD和GPX活性,上述试验说明热应激抑制了Nrf2信号通路的激活。早期研究发现,饲粮中添加白藜芦醇促进热应激肉鸡脾脏中Nrf2、CAT、MnSOD和GRmRNA表达水平,提高T-SOD、CAT和GSH多种抗氧化酶活性[6];Sahin等[32]以鹌鹑为研究对象,发现白藜芦醇可线性提高肝脏中Nrf2含量,并提高肝脏中SOD、CAT和GPX活性,这些研究都表明白藜芦醇作为饲料添加剂是缓解热应激导致的抗氧化系统紊乱的有效手段[33]。本试验结果显示,热应激显著降低了肉鸡肝脏中Nrf2、HO-1和SOD1的mRNA表达量,同时提高了Keap1的mRNA表达量,提示热应激抑制了Nrf2通路的激活,这可能是热应激诱导肝脏发生氧化应激损伤的主要原因;而饲粮中添加白藜芦醇显著提高了热应激肉鸡肝脏中Nrf2、HO-1和SOD1 mRNA表达量及GPX和SOD活性,并显著降低了Keap1mRNA表达水平,说明白藜芦醇可有效缓解热应激对肉鸡抗氧化系统的损伤,其机制可能归因于白藜芦醇对Nrf2信号通路的激活。

综上,饲粮添加白藜芦醇对热应激肉鸡的生长性能、免疫器官发育、血清生化指标及抗氧化能力具有有益作用;白藜芦醇能提高热应激肉鸡的抗氧化能力,进而缓解氧化损伤的机制可能与其激活Nrf2信号通路关键抗氧化基因的表达有关。