细胞坏死性凋亡抑制剂对糖尿病小鼠肾损伤的治疗作用

付莹

天津市北辰医院老年病科，天津300400

坏死性凋亡（Necroptosis）属于细胞新型死亡方式，与传统意义上的细胞坏死、凋亡存在一定差异，具有凋亡和坏死两种特性。有研究指出，在Necroptosis 传导过程中受体相互作用蛋白1（RIP1）、受体相互作用蛋白3（RIP3）起非常关键的作用，因此RIP1、RIP3 是判断组织细胞发生 Necroptosis 的重要指标［1］。Necroptosis 在机体炎症损伤过程中发挥着重要作用，并且参与多种疾病（缺血性器官损伤、急性坏死性胰腺炎）的发生发展［2］。Necroptosis在纤维化及炎症反应中均有重要作用，但关于Necroptosis在糖尿病肾病中作用的研究较少［3］。2020 年1 月—12月，本研究构建糖尿病小鼠模型，观察Necroptosis抑制剂Nec-1对小鼠肾损伤的预防效果。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 6～8 周龄SPF 级小鼠48只，由凯学（上海）生物科技有限公司提供，均为健康雄性C57BL/6J 小鼠，体质量20～25 g，于SPF 清洁级饲养笼进行为期1周的适应性饲养。本研究已获得动物医学伦理委员会批准。组织蛋白裂解液（美国Abcam 公司），4%多聚甲醛（美国Sigma 公司），6×蛋白样品的上样稀释缓冲液（北京Solarbio 公司），10%过硫酰胺溶液配制（北京Solarbio公司），30%丙烯酰胺凝胶液（德国Boehringer 公司），1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8，日本TaKaRa 公司），0.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8，珠海贝索生物技术有限公司），蛋白样品电泳缓冲液（美国Sigma 公司），蛋白样品转膜缓冲液（北京Solarbio 公司），TBST（北京Solarbio 公司），0.01 mol/L 柠檬酸抗原修复液配制（加拿大Abcam公司），0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液（美国Millipore 公司）。血糖分析仪（美国强生公司），石蜡包埋机、石蜡切片机（德国LEICA 公司），电子恒温水浴锅、电热恒温干燥箱（天津市华北实验仪器有限公司），北京四环科学仪器厂、台式高速冷冻离心机（上海精科实业有限公司），光学显微镜、全自动显微照相（系统日本Olympus），垂直电泳槽（美国Bio-rad 公司）。

1.2 动物分组及模型构建 按照双盲、随机原则将小鼠分为对照组、糖尿病组、Nec-1 对照组、糖尿病+Nec-1组，每组12只。糖尿病组、糖尿病+Nec-1组制备糖尿病模型，给予腹腔注射链脲佐菌素（STZ），50 mg/kg，连续5 d。采集小鼠尾尖血，检测血糖高于11.1 mmol/L 时为糖尿病模型制备成功。造模当天，Nec-1对照组、糖尿病+Nec-1组经腹腔注射Nec-1 1 mg/（kg·d），对照组、糖尿病组经腹腔注射等体积枸橼酸盐缓冲液。实验期间各组小鼠正常饲养，不进行药物治疗。

1.3 标本收集 完成STZ 注射后24 周，收集各组24 h 尿液，用于检测尿蛋白。完成尿液收集后随之为小鼠称重，获得体质量。称重后抽取静脉血，经股动脉取血，3 500 r/min 离心10 min，离心半径25 mm，分离血清，用于检测尿素氮（BVN）、血糖、血肌酐（Scr）。抽血完成后对小鼠用5%水合氯醛（7 mL/kg）进行腹腔麻醉，解剖分离肾脏，记录肾湿重，于冰上进行肾脏被膜分离，切取部分肾组织用甲醛固定，取样位置为肾门横断面，用于Masson 染色、PAS 染色、HE 染色以及免疫组化法检测；将剩余的肾组织-80 ℃低温保存，用于荧光定量PCR 检测及Western blotting法检测。

1.4 血液生化指标检测 采用全自动生化分析仪对尿液、血清样本尿蛋白（UAE）、Scr、血糖进行检测。

1.5 肾组织病理变化观察 HE 染色：取甲醛固定的肾组织样本，经不同浓度乙醇梯度脱水，并用二甲苯透明处理，制成石蜡切片（3 μm 厚），经脱蜡处理后进行苏木素染色，后经伊红复染，再次经脱水、透明处理后制成树胶封片，镜下观察。PAS染色：取制备好的组织切片，脱蜡处理后进行Schiff 染液染色，苏木素复染，经脱水、透明后制成树胶封片，镜下观察。Masson 染色：取制备好的病理切片进行烤片处理，经脱蜡处理后置于蒸馏水中，首先进行Weigert铁苏木素染色，后经盐酸乙醇分化处理后水洗，经酸性丽春红品红溶液染色，水洗后用磷钼酸溶液及苯胺蓝依次染色。完成染色后使用冰醋酸进行处理，经脱水、透明后制成树胶封片。

1.6 肾组织中白细胞介素1β（IL-1β）、RIP1、RIP3、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、转化生长因子β（1TGF-β1）蛋白表达检测 采用Western blotting 法。对肾组织进行裂解处理，经高速离心处理，12 000 r/min离心20 min，离心半径25 mm，分离上层清液即为组织蛋白样本。采用考马斯蓝法对肾组织蛋白进行定量，准备空白管、样品管及标准蛋白管，在各管中加入配置好的考马斯蓝溶液，对照组管中加入蒸馏水，标准管中加入标准蛋白，样本管中加入对应蛋白，用分光光度计对吸光度进行测定。调整各个组蛋白浓度根据测定结果。取调整浓度后的蛋白样本，经电泳、转膜等处理，依次加入一抗、二抗，孵育结束后加入显色试剂，用Odyssey双色红外激光成像系统进行图像扫描，分析各蛋白灰度值，以GAPDH作为内参照，目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值为目标蛋白相对表达量。

1.7 肾皮质中 IL-1β、ColⅠ、TGF-β1、肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA 表达检测 采用荧光定量PCR。用RNA提取试剂盒提取肾组织RNA，严格按照试剂盒说明书进行操作，对提取后的RNA 浓度及纯度进行测定。将RNA 样品反转录成cDNA，总体积20 μL，其中 MgCL24 μL、反转录 10×Buffer 2 μL、dNTP 混合物 2 μL、Rnase inhibitor 0.5 μL、AMV 0.6 μL、随机引物 1 μL、2 μg 总 RNA 及三蒸水充分混合，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，待温度降至4 ℃后取出样品管引物序列。IL-1β 上游引物序列5'-CTTCAGGCAGGCAGTATC-3'、下游引物序列5'-CAGCAGGTTATCATCATC-3'；ColⅠ上游引物序列5'-CTGGAAGAGCGGAGAGTA-3'、下游引物序列5'-CTGTAGGTGAAGCGACTG-3'；TGF-β1上游引物序列5'-GCAACAACGCCATCTATG-3'、下游引物序列5'-CAAGGTAACGCCAGGAAT-3'；TNF-α上游引物序列5'-GTGGAACTGGCAGAAGAG-3'、下游引物序列5'-GCTACAGGCTTGTCACTC-3'；以 CAPDH 作为内参照，上游引物序列5′-ACACGGACAGGATTGACAGA-3′，下游引物序列 5′-GGACATCTAAGGGCATCACAG-3′。反应体系：Forward primer 0.8 μL、Reverse primer 0.8 μL、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10 μL、三蒸水6 μL、cDNA模板2 μL，混匀，设3个复孔。反应条件：95 ℃10 min，40 个循环，循环条件为95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，4 ℃保存。用 2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.8 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计量资料符合正态分布用表示，多组比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况比较 对照组反应敏捷、毛色光亮，精神状态佳；糖尿病组造模第5 天开始出现多食、多饮、多尿，且反应迟钝、毛色暗淡；Nec-1 对照组毛色光亮、反应敏捷，精神状态佳；糖尿病+Nec-1组表现与糖尿病组相似，但症状较轻。各组体质量、肾质量、肾质量/体质量比较见表1。

表1 各组体质量、肾质量、肾质量/体质量比较（）

表1 各组体质量、肾质量、肾质量/体质量比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与糖尿病组比较，bP＜0.05。

组别对照组糖尿病组Nec-1对照组糖尿病+Nec-1组肾质量/体质量0.014±0.001 0.025±0.002a 0.011±0.001 0.011±0.003b n 12 12 12 12体质量（g）28.12±0.36 24.28±0.39a 29.18±0.29 25.48±0.46肾质量（g）0.43±0.05 0.58±0.11a 0.36±0.12 0.30±0.17b

2.2 各组生化指标比较 见表2。

表2 各组生化指标比较（）

表2 各组生化指标比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与糖尿病组比较，bP＜0.05。

组别对照组糖尿病组Nec-1对照组糖尿病+Nec-1组血糖（mmol/L）6.28±0.15 27.15±1.57a 7.05±1.11 26.15±1.81b n 12 12 12 12 BUN（mmol/L）6.81±0.27 12.54±1.67a 6.59±0.39 7.30±0.12b Scr（μmol/L）3.12±0.05 8.74±0.23a 3.26±0.11 3.21±0.31b UAE（μg/24 h）20.13±1.37 119.8±76.74a 20.94±1.87 31.64±1.84b

2.3 各组肾组织病理学变化 PAS及HE染色结果显示：对照组肾组织无异常变化，肾小球结构正常，无炎症反应；糖尿病组毛细血管狭窄，肾小球增大，局部肾小管上皮出现空泡变性，肾小管管腔扩增；Nec-1 对照组肾组织结构与对照组相似，无炎症反应；糖尿病+Nec-1 组炎症反应较糖尿病组轻，肾小管管腔扩张不明显，上皮细胞存在轻微损伤。Masson 染色结果显示：对照组肾间质无蓝色胶原沉淀，肾组织无纤维化；糖尿病小鼠肾间质存在胶原沉淀，肾组织明显纤维化；Nec-1 对照组肾间质无蓝色胶原沉淀，肾组织无纤维化；Nec-1 组蓝色沉淀较少，且肾纤维化有所改善。

2.4 各组肾皮质IL-1β、RIP1、RIP3、ColⅠ、TGF-β1、TNF-α蛋白表达比较 见表3。

表3 各组肾皮质IL-1β、RIP1、TNF-α、TGF-β1、RIP3及ColⅠ蛋白表达比较（）

表3 各组肾皮质IL-1β、RIP1、TNF-α、TGF-β1、RIP3及ColⅠ蛋白表达比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与糖尿病组比较，bP＜0.05。

组别对照组糖尿病组Nec-1对照组糖尿病+Nec-1组TNF-α蛋白0.18±0.02 0.98±0.10a 0.16±0.04 0.23±0.07b n 12 12 12 12 IL-1β蛋白0.17±0.02 0.29±0.05a 0.63±0.12 0.23±0.07b RIP1蛋白0.15±0.03 0.74±0.11a 0.21±0.02 0.23±0.06b RIP3蛋白0.14±0.02 1.21±0.11a 0.18±0.02 0.18±0.04b ColⅠ蛋白0.12±0.03 0.71±0.15a 0.13±0.01 0.19±0.06b TGF-β1蛋白0.32±0.07 1.75±0.12a 0.42±0.06 0.48±0.17b

2.5 各组肾皮质IL-1β、ColⅠ、TGF-β1、TNF-α mRNA表达比较 见表4。

表4 各组肾皮质IL-1β、ColⅠ、TGF-β1、TNF-α mRNA表达比较（）

表4 各组肾皮质IL-1β、ColⅠ、TGF-β1、TNF-α mRNA表达比较（）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与糖尿病组比较，bP＜0.05。

组别对照组糖尿病组Nec-1对照组糖尿病+Nec-1组TNF-α mRNA 1.02±0.07 2.26±0.37a 1.07±0.16 1.36±0.27b n 12 12 12 12 IL-1β mRNA 1.00±0.12 3.21±0.43a 0.98±0.11 1.23±0.21b ColⅠmRNA 1.00±0.05 3.29±0.47a 1.12±0.09 1.31±0.29b TGF-β1 mRNA 1.01±0.03 3.89±0.17a 1.08±0.32 1.34±0.16b

3 讨论

研究发现，有多种途径导致糖尿病肾病的发生。多数认为糖尿病肾病的病理基础为肾间质无菌性炎症反应及后期纤维化。因此，如何有效控制糖尿病患者肾组织炎症及肾间质纤维化对于预防糖尿病肾病有重要意义［4］。Necroptosis 与程序性死亡不同，同时具备死亡及坏死特性，在凋亡信号被阻断后，其功能可转变为坏死，从而促进组织损伤的发生［5］。

体质量、肾质量、肾质量/体质量属于评估小鼠生存状态的常见指标，疾病严重程度可直接影响小鼠体质量、肾质量，肾质量可在一定程度上反映小鼠肾组织水肿情况。有研究指出，随肾组织损伤程度加重，肾脏受炎症影响极易出现水肿。本研究结果显示，与对照组比较，糖尿病组体质量小、肾质量大、肾质量/体质量高；与糖尿病组比较，Nec-1 组肾质量小、肾质量/体质量低。提示Nec-1 干预可致使糖尿病肾病损伤减轻，对高血糖引起的肾组织肥大起抑制作用。血糖水平过高是导致肾组织损伤的关键因素，因此有效控制血糖对于缓解肾组织损伤有着重要意义。BUN、Scr、UAE 为临床常用肾功能评估指标，其水平可一定程度上反映疾病进展程度及疾病控制情况。本研究对小鼠BUN、Scr、UAE、血糖水平进行分析，结果显示糖尿病小鼠BUN、Scr、UAE、血糖水平均升高，且Nec-1 干预可有效降低BUN、Scr、UAE、血糖水平。提示Nec-1可逆转高血糖导致的肾功能损伤。

糖尿病肾病具有非常复杂的病理过程，其中肾组织炎症及肾小管间质纤维化为主要病理表现。肾损伤的主要标志性体现即为肾间质纤维化及肾小球损害。Nec-1 干预可有效改善输尿管梗阻小鼠肾组织形态改变［6］。Nec-1 可通过影响 RIP3/DAXX 信号通路减轻小鼠神经损伤［7］，缩小神经损伤面积［8］。由此可以看出，评估肾间质纤维化程度对于了解糖尿病肾病肾损伤程度有重要意义。本研究结果显示，糖尿病小鼠存在肾间质纤维化及肾小球损伤，而经Nec-1 干预后小鼠肾小管管腔扩张情况明显改善，Nec-1 干预对于糖尿病引起的肾间质胶质纤维沉积可以起到抑制作用，从而有效减轻肾间质纤维化的产生。提示在糖尿病小鼠机体内存在Necroptosis 凋亡情况，并且Necroptosis 会参与糖尿病的肾损伤过程，经Nec-1干预可有效起到肾脏保护作用。

RIP1、RIP3 在 Necroptosis 过程中起重要作用［9］。小分子物质Nec-1 是Necroptosis 抑制剂，对RIP1、RIP3相互磷酸化起抑制作用，进而抑制Necroptosis。已有大量研究将Nec-1 作为Necroptosis 的特异性抑制剂，分析其在多种疾病组织损伤中的干预效果［10］。Nec-1 干预可有效降低PIP1、PIP3 水平，由此看出，Nec-1对于Necroptosis 可起到抑制作用。曾有研究指出，在肾间质纤维化的发生及发展过程中，炎症因子发挥着非常重要的作用，而Necroptosis 参与集体炎症发展，猜测Necroptosis 在肾间质纤维化发生、发展过程中同样具有关键作用［11］。在多种炎症性疾病的发生发展过程中均有Necroptosis 的参与，当机体出现病毒感染时，感染细胞可经凋亡方式被清除，而部分病毒会释放对凋亡机制产生抑制作用的因子，正常凋亡机制被Necroptosis 取代，而此过程中大量细胞内容物外泄，促进机体炎症的发生。Necroptosis 形式的凋亡对炎症发展可起到促进作用，在多种炎性疾病患者中存在Necroptosis 发生［12］。Nec-1 对于小胶质细胞活化可起到抑制作用，并且降低炎症反应程度，对大脑皮质神经功能起到保护作用［13］。本研究结果显示，糖尿病小鼠存在Necroptosis 情况，经Nec-1 干预可有效降低肾间质炎症程度，降低IL-1β、TNF-α 等炎症因子表达，在对肾间质纤维化关键因子ColⅠ、TGF-β1蛋白及mRNA表达情况进行分析时发现，Nec-1 可有效抑制该类因子表达，达到抑制肾间质纤维化的目的，提示Nec-1 干预可有效降低肾组织炎性浸润。将PIP2 基因敲除可对急性肝损伤模型小鼠肝细胞纤维化基因表达起抑制作用，用Nec-1 进行干预，可有效抑制肾间质纤维化的发生，起肾保护作用［14］。本研究特别设立Nec-1对照组，证实Nec-1 不会对正常大鼠各项指标产生影响，从而避免Nec-1 干扰，提高研究数据的准确性。

综上所述，Necroptosis 可参与糖尿病肾损伤的发生，采用Necroptosis 抑制剂干预可有效抑制肾小管细胞炎症以及肾间质纤维化，对糖尿病患者起到肾保护作用，猜测可通过干预Necroptosis 的方式进行糖尿病肾病防治。